不同保存方法對厚殼貽貝樣品蛋白提取效果的比較

楊金龍 , 李無霜 梁 簫 沈和定 , 李家樂

(1. 上海海洋大學 農業部淡水水產種質資源重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海市水產養殖工程技術研究中心, 上海 201306; 3. 上海高校知識服務平臺上海海洋大學水產動物遺傳育種中心, 上海 201306)

隨著生物化學技術的不斷深入發展, 在海洋無脊椎動物中有關蛋白質的研究也越來越多。其中western blot用來對蛋白表達做定量定性分析, 2-DE和質譜技術等相結合鑒定蛋白質組分。這一系列蛋白質研究技術都有賴于對樣品蛋白的提取。在研究厚殼貽貝等海洋無脊椎動物不同發育階段過程中,其新鮮樣品的采集受到很大程度的限制, 例如采樣時間、采樣地點等, 為蛋白相關研究工作的開展帶來了諸多困難。

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是中國重要的貝類養殖品種, 分布于黃海、渤海和東海沿岸, 其中以浙江沿海資源量最大。關于厚殼貽貝的其遺傳特性[1]、附著特性[2]、低溫保存[3]、繁殖發育[4,5]、生態毒理[6]等方面已開展了大量的研究工作, 主要集中在厚殼貽貝的幼體和成體兩個發育階段。與許多其他海洋無脊椎動物一樣, 厚殼貽貝幼體也要經過重要的階段—附著和變態, 在變成附著稚貝后, 其附著數量直接影響著苗種的產量。然而, 關于厚殼貽貝稚貝的研究鮮有報道[7]。

目前, 有關不同保存方法提取蛋白的比較研究尚未見報道, 本實驗以厚殼貽貝稚貝為材料, 采用直接冷凍法、添加海水冷凍法以及蛋白裂解液冷凍法等3種保存方法。分別保存1周、2周、3周、4周、2個月、3個月和6個月對其進行蛋白提取, 聚丙烯酰胺凝膠電泳對所提蛋白進行比較分析, 旨在探尋合適保存樣品的方法用以提取蛋白以供進一步研究。

1 材料和方法

1.1 樣品處理

厚殼貽貝樣品采集于浙江洞頭的稚貝, 其平均殼長2.8 mm, 殼高1.8 mm。實驗室暫養1周后, 挑選健康狀態良好的稚貝收集于離心管, 分別用 3種不同方法進行保存。

直接冷凍法為直接將樣品用液氮快速冷凍, 后放入-80℃冰箱保存; 海水冷凍法時, 向樣品中添加1 mL 滅菌海水, 后用液氮快速冷凍, 最終保存于-80℃冰箱中; 蛋白裂解液冷凍法為向樣品中添 1 mL蛋白裂解液(10 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 5% Tritonx-100和2 mmol/L PMSF), 用液氮快速冷凍, 最終放入-80℃冰箱保存。實驗過程中, 保存時間為1周、2周、3周、4周、2個月、3個月和6個月。

1.2 蛋白樣品的制備

直接冷凍法中蛋白樣品制備時, 先進行樣品稱質量, 加入 4倍體積的蛋白裂解液, 于冰上勻漿 3次, 每次30 s, 將勻漿液分裝到1.5 mL離心管, 4℃10 000 g離心30 min, 收集上清即為可溶性蛋白。海水冷凍法中蛋白樣品制備時, 將樣品溶解, 除去其中的滅菌海水, 加入4倍體積的蛋白裂解液, 勻漿和離心方法同上。蛋白裂解液冷凍法中蛋白樣品制備時, 將樣品溶解后, 將 1 mL蛋白裂解液吸出, 置于1.5 mL離心管中稱質量, 計算出所需裂解液的總量。將原有1 mL蛋白裂解液和補充裂解液加入, 最終為4倍體積的蛋白裂解液, 勻漿和離心方法同上。

1.3 蛋白定量

將制得的蛋白上清取20 μL稀釋到100 μL后用Lowry法蛋白含量測定試劑盒(PRL000100), 測定不同保存時間, 各保存方法蛋白樣品中所含的蛋白量。

1.4 SDS-PAGE電泳檢測

取 100 μL 蛋白原液, 加入 100 μL SDS-buffer上樣緩沖液, 水浴煮沸 10 min制成上樣樣品。上樣量為10.05 μg蛋白, 用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離, 考馬斯亮藍染色, 伯樂凝膠成像系統拍照記錄。結果用Quantity One軟件估算條帶的相對分子量及灰度值。

2 結果

3種保存方法在不同保存時間內所提蛋白樣品的質量如圖1所示。SDS-PAGE膠上最為明顯有規律的4個條帶a、b、c、d, 其相對分子量依次約為55、46、38和26 kDa。同時, 基于SDS-PAGE蛋白條帶,Quantity One軟件檢測條帶a, b, c, d的灰度值結果如表1所示。分析條帶a發現, 3種保存方法均在保存3周內未檢測到條帶, 到第4周條帶明顯, 保存時間延長至2個月時條帶灰度值增加, 保存3個月時出現減弱趨勢, 到保存 6個月后條帶的灰度值降為 0。3種保存方法下, 條帶 a的灰度值總體趨勢均呈先增加后減少。分析條帶b可發現, 直接冷凍保存法與添加海水冷凍法均呈先增加后降低趨勢; 蛋白裂解液冷凍法研究結果發現保存1個月內呈逐漸降低趨勢,當保存 2個月后條帶灰度值呈現增加。分析條帶 c的灰度值發現, 3種不同保存方法整體趨勢呈增加趨勢。同樣, 條帶 d在6個月保存時間內, 3種保存方法整體趨勢也呈增加趨勢。由此可見, 條帶a的灰度值在 3種不同保存方法下呈現相同趨勢, 無法作為鑒定保存方法良否的依據。同樣, 條帶c和d的灰度值在 3種不同保存方法下呈現相同趨勢, 無法作為鑒定保存方法良否的依據。直接冷凍法和添加海水冷凍法結果均顯示條帶 b的灰度值呈現先增加后降低趨勢; 蛋白裂解液冷凍法結果與前兩種保存方法不同, 呈先降低后增加趨勢。因此, 將條帶b可作為衡量3種保存方法良否的標準。

3 討論

對不同保存方法DNA提取比較的研究已經很深入, 例如冷凍保存、75%乙醇保存、EDTA結合乙醇保存以及甲醛等保存方法[8-10]。然而, 有關保存方法和保存時間對樣品蛋白提取影響的研究工作還未開展。作者首次通過直接冷凍法、添加海水冷凍法以及蛋白裂解液冷凍法等 3種方法開展了厚殼貽貝稚貝樣品的保存工作, 確定了其最佳樣品保存方法。

樣品冷凍保存過程中蛋白酶的存在可能導致樣品中蛋白發生不同程度的降解。自然界中根據蛋白酶活性中心分為四大類蛋白酶, 分別為絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、巰基蛋白酶以及酸性蛋白酶。在本研究中, 研究對象厚殼貽貝其生活史、包括稚貝在內的各個發育階段均生活在海水環境中; 自然海水一般偏堿性, 絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶具有一定的活性, 可能會降解相關蛋白, 在蛋白裂解液中, 因而選用了2種蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA, 分別可抑制絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。直接冷凍法和添加海水冷凍法的結果表明a、b、c、d 等4條條帶在6個月保存過程中, 呈現整體增加的趨勢。原因可能是由于在保存過程中, 無添加任何蛋白酶抑制劑,促使較大分子量的蛋白在蛋白酶的作用下, 出現降解現象, 其分解產物在原有a、b、c、d等4條條帶上基礎出現累積現象。蛋白裂解液冷凍法的研究發現, 條帶a、c、d與直接冷凍法和添加海水冷凍法結果相似, 均呈整體增加趨勢, 其原因可能是由于在蛋白裂解液中添加的 2種蛋白酶抑制劑 PMSF和EDTA無法完全抑制樣品中一些大分子量蛋白的降解; 此外, 可能由于其余兩大類的蛋白酶巰基蛋白酶和酸性蛋白酶發揮了作用, 導致大分子量蛋白的降解。條帶b在1個月內呈現降低的趨勢, 之后呈增加的趨勢, 其原因可能是在蛋白裂解液中添加的 2種蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA在一定程度上抑制了樣品中一些大分子量蛋白的降解, 從而使分解產物未在條帶b上基礎進行累積。這一過程中, 條帶b的減少, 可能是其樣品保存過程中損耗所導致。此外,條帶b的結果發現保存2個月后其灰度值出現增加現象, 可能是由于長時間保存過程中蛋白裂解液中添加的2種蛋白酶抑制劑的作用減弱所致。

圖1 不同保存條件下的厚殼貽貝稚貝蛋白樣品SDS-PAGEFig. 1 SDS-PAGE of samples of Mytilus coruscus juvenile stored in different methods

表1 不同保存方法的蛋白條帶分析Tab. 1 The analysis of SDE-PAGE in different methods

綜上, 條帶 b可作為厚殼貽貝稚貝樣品保存方法良否的標準。1個月內, 蛋白裂解液中的方法最佳,直接冷凍法和添加海水冷凍法的研究發現保存過程中的蛋白均出現不同程度的降解現象, 因而可能不適宜用于該種稚貝樣品的保存。

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