長牡蠣中國群體與日本群體雜交子一代的生長和存活比較

孔令鋒, 滕爽爽, 李 琪

(中國海洋大學 海水養殖教育部重點實驗室, 山東 青島 266003)

長牡蠣(Crassostrea gigas), 俗稱太平洋牡蠣,是世界性的水產養殖種類[1]。長牡蠣的產量在世界所有漁業和養殖的貝類種類中位居首位, 2010年全球產量達 66萬噸, 產值約 12.6億美元[2]。在我國, 長牡蠣大規模的人工育苗與養殖始于20世紀70年代末和80年代初, 目前遼寧、山東、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等沿海地區已成為長牡蠣的主要養殖產區, 2010年全國牡蠣的總產量超過364萬噸, 占我國貝類養殖總產量的32.9%[3], 取得了顯著的經濟效益和社會效益。近年來, 隨著養殖規模的擴大, 長牡蠣的產量大幅度提高, 但品質卻在下降, 種質也出現退化, 表現出出肉率低下、形態不規則、肉質不好等缺點[4-5], 因此, 市場價格偏低, 達不到牡蠣活體出口標準, 嚴重影響了牡蠣養殖業的健康、穩定和持續發展。雖然通過改善生態環境和養殖結構能夠使上述問題得到一定程度的解決, 但從長遠上, 還需要深入研究牡蠣的種質資源, 培育出產量高、品質好的長牡蠣優良品種。

雜交育種是遺傳育種的主要手段之一, 是改良遺傳性狀、培育優良品種的可靠途徑。雜交育種的主要目的是獲得雜種優勢, 由于雜種優勢和雜種活力的存在, 雜交能迅速和顯著地提高雜種的產量和生活力[6-7]。因此雜交育種廣泛應用在動植物的種質改良中[8-11], 并且在水產動物的品種改良和生產中發揮了重要作用[12]。

近年來, 許多研究報道了貝類群體間雜交的結果。不同群體雜交的子代在生長、存活和生產性能等方面的表現都優于其親本的自繁群體。Cruz等[13]對扇貝(Argopecten circularis)的兩個群體進行了雜交實驗, 他們發現在幼蟲初期殼長生長存在明顯的母體效應, 在第15天后存在一定的雜種優勢。劉小林等[14]進行了櫛孔扇貝中國群體和俄羅斯群體的雜交實驗, 對雜交后代和親本群體后代進行了比較, 發現雜交后代在殼高、殼長、殼寬和活體質量 4個生長發育指標上均表現不同程度的雜種優勢。Zhang等[15]開展了海灣扇貝加拿大群體和墨西哥灣群體的雜交實驗工作, 對雜種一代及對照群體的生長和存活進行了比較, 在第 10天后, 兩個雜交組的殼長顯著大于兩個對照群體, 體現出明顯的雜種優勢。但有關牡蠣不同群體或亞種間的雜交還少有報道。Newkirk等[16]和Newkirk[17]報道了美洲牡蠣C. virginica4個種群雜交后代在存活率和生長方面優于親本。Stiles[18]利用C. virginica不同地理種群以及與C. gigas進行了雜交, 結果表明不同地理種群間雜交后代幼體的存活率和生長速度都比種間雜種要高。

為了探索利用雜交培育長牡蠣優良養殖新品種的可行性, 本研究利用長牡蠣中國群體和日本群體進行雜交實驗, 比較不同雜交組與對照組幼蟲、稚貝及養成期的生長、存活, 研究雜交組是否存在雜種優勢, 進而為長牡蠣的雜交育種提供理論依據, 為長牡蠣雜交的生產實踐提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 材料

長牡蠣中國群體為2007年群體選育F1子代, 日本群體為2007年群體選育F1子代。實驗于2008年5月在山東省文登市水產綜合育苗試驗基地進行。

1.2 實驗設計

利用長牡蠣中國群體與日本群體進行 4個組合的雜交與自交試驗, 雜交實驗組: 長牡蠣中國群體♀ × 長牡蠣日本群體♂(C♀ × J♂, CJ), 長牡蠣日本群體♀ × 長牡蠣中國群體♂(J♀ × C♂, JC),自交實驗組: 長牡蠣中國群體♀ × 長牡蠣中國群體♂(C♀ × C♂, CC), 長牡蠣日本群體♀ × 長牡蠣日本群體♂(J♀ × J♂, JJ)。實驗設2個重復。

1.3 人工授精, 孵化及幼蟲培育

從每個群體中選擇雌雄各10個性腺發育完全成熟的個體。采用解剖法收集卵子, 在盛有10 L, 24℃海水的小桶中促熟, 將長牡蠣中國群體10個雌性個體的卵子充分混合; 同樣操作獲得混合的長牡蠣中國群體精子, 長牡蠣日本群體卵子和長牡蠣日本群體精子。再把兩個群體的卵子等份分開, 每一群體的卵子分別與群體內或群體間的精子授精。得到四個交配組合 C♀ × C♂, C♀ × J♂, J♀ × C♂, J♀ × J♂。

孵化時持續微充氣, 并每隔 1～2 h 攪拌一次,以防止受精卵的堆積。受精后24 h, 受精卵發育到D形幼蟲。將每個交配組合的幼蟲分別選幼至 100 L聚乙烯桶中培育, 設 3組重復, 初始 D形幼蟲密度10個/mL, 水溫控制在 23～24℃, 持續充氣, 每天換水一次, 換水量1/3。隨著幼蟲長大, 增大換水量, 到面盤幼蟲后期, 日換水量 1/2, 所用海水經過砂濾處理。餌料以等邊金藻(Isochrysis galbana)為主, 后期輔助投喂扁藻(Platymonassp.), 牟氏角毛藻(Chaetoceros muslleri), 投餌量根據幼蟲的攝食情況和水中殘餌情況確定。各實驗組投餌、換水、充氣等操作一致。所用試驗器具都在淡水中浸泡 5 min,以殺死殘留在網上的幼蟲, 以防混雜污染, 各試驗組之間嚴格避免相互混雜。

1.4 稚貝中間培育及養成

大約 22 d后, 幼蟲開始陸續出現眼點, 當30%左右的幼蟲出現眼點時, 開始投放附著基。在室內繼續培養 15 d后, 掛到室外在沉淀池暫養, 確認自然海區無野生牡蠣浮游幼蟲污染后, 轉至文登市東港海上籠式浮筏懸掛養殖。各實驗組的放養密度、水層深度等環境條件均保持一致。養成期間, 每隔2月將籠取回, 剔出籠上附著生物, 觀察生長情況, 并逐漸疏散密度。

1.5 分析的性狀、取樣及測量

分析的性狀包括: (1)受精率; (2)孵化率; (3)幼蟲期, 殼高、殼長和存活率; (4)稚貝和養成期, 殼高、殼長和存活率。

受精率(%)= 出現第一極體的卵子/所有卵子 ×100;

孵化率(%)= 孵化出的D形幼蟲/受精卵 × 100;

幼蟲期存活率(%)= 測量日存活的幼蟲/第1天的幼蟲 × 100;

稚貝養成期存活率(%)= 測量日存活的稚貝/第60天的稚貝 × 100;

幼蟲期, 在第1, 5, 10, 15, 20, 25天取樣, 每組每次取樣30個體, 用盧戈氏液殺死固定, 在100 ×的顯微鏡下, 用目微尺測量測量其殼高、殼長; 稚貝和養成期, 在第60, 100, 150, 210, 280天, 各實驗組取樣30個, 用游標卡尺(精度0.02 mm)測量殼高、殼長。

1.6 數據分析

計算雜交子代各性狀的雜種優勢率(H, Heterosis), 公式為:

式中,F1為雜交子代性狀的平均值,P為兩自交組子代性狀的平均值[19]。

用EXCEL軟件統計4個實驗組間在不同階段各性狀指標的平均數和標準差, 并采用SPSS13.0統計分析軟件對 4個實驗組間數據進行單因素方差分析及Tukey’s多重比較分析。

2 結果

2.1 受精率、孵化率的比較

4個實驗組的受精率變化范圍為 76.76%～91.33%,其中JC組的受精率最低, 為76.76%, CJ組的受精率最高, 為 91.33%, 自交組 CC和 JJ的受精率介于雜交組CJ和JC之間, 經方差分析表明, 雜交組與自交組之間無顯著差異。4個實驗組的孵化率變化范圍為71.25%～96.00%, 其中 CJ組的孵化率最低, 為71.25%, JJ組的孵化率最高, 為96.00%, 相同卵子來源的組合在孵化率上無差異, 即CC組與CJ組之間,JC組與JJ組之間無顯著差異(表1)。

2.2 幼蟲期生長、存活以及雜種優勢率的比較分析

2.2.1 幼蟲期殼高、殼長的比較分析

本雜交實驗中, 幼蟲期自 1 d起, 到投附著基,自交組JJ和雜交組JC的殼高始終大于自交組CC和雜交組CJ, 經方差分析表明, JJ組和JC組之間, CC組和 CJ組之間無顯著差異(P＞0.05), 即相同卵子來源的組合在殼高上無差異; 而 JJ、JC與 CC、CJ各組之間差異顯著(P＜0.05)。到了25 d, JJ組殼高最大,為 266.2 μm; 其次是 JC 組, 為 258.1 μm; CJ組為238.2 μm; CC 組殼高最小, 為 222.5 μm。幼蟲期間, 4個實驗組的殼長生長趨勢與殼高相同, 即自交組 JJ和雜交組JC的殼長始終大于自交組CC和雜交組CJ。在25 d, JJ組生長最快, 殼長為241.9 μm; JC組殼長略微小于 JJ組, 為 237.7 μm; CJ組殼長 215.4 μm; CC組殼長最小, 僅為 195.7 μm(表 2)。

表1 各實驗組的受精率、孵化率比較Tab. 1 Comparison of fertilized rate and hatching rate of the four groups (%)

表2 幼蟲期各實驗組幼蟲的殼高和殼長Tab. 2 Shell height and shell length of the four groups at larvae stage (μm)

2.2.2 幼蟲期存活率的比較分析

兩個自交組和雜交組幼蟲階段的存活率如表 3所示。在5～15 d, JC組和CC組的存活率明顯大于JJ組和CJ組; JC、CC和JJ、CJ各組之間差異顯著。15 d后, CC組和CJ組的存活率出現明顯下降, CC組的存活率由15 d的74.8%下降到20 d的25.6%, CJ組由53.5%下降到4.9%; 而JC組和JJ組存活率無明顯下降。到了25 d, 4個實驗組的存活率均出現明顯下降現象, 方差分析表明, CC組和CJ組之間, JC組和JJ組之間無顯著差異。

2.2.3 幼蟲期雜種優勢率的比較分析

幼蟲階段, 雜交組生長和存活的雜種優勢率見表 4。同自交組相比, 雜交組 JC在殼高、殼長和存活率上均具有明顯的雜種優勢, 并且在幼蟲生長階段, 雜交組JC的殼高、殼長和存活率的雜種優勢率隨著生長逐漸增加。1～25 d, JC組殼高的雜種優勢率為 0.85%～5.63%, 殼長的雜種優勢率為 0.29%～8.64%,存活率的雜種優勢率為12.31%～96.45%, 而CJ組則無雜種優勢率。

表3 幼蟲期各實驗組幼蟲的存活率Tab. 3 Percent survival means of the four groups at larvae stage (%)

表4 幼蟲期各雜交組生長和存活的雜種優勢率Tab. 4 Heterosis for growth and survival of the four groups at larvae age

2.3 稚貝、養成期生長、存活以及雜種優勢率的比較分析

2.3.1 稚貝、養成期殼高、殼長的比較分析

各實驗組稚貝在60, 100, 150, 210和280日齡的殼高和殼長的生長變化見表5。CC, CJ, JC, JJ 4個實驗組的殼高和殼長隨著日齡的增加均呈上升趨勢,280日齡時殼高分別為23.1, 29.6, 33.3, 37.4 mm, 殼長分別為17.6, 22.2, 26.8, 28.2 mm。在整個稚貝, 養成期, 雜交組CJ和JC的平均殼高、殼長均介于自交組CC和JJ之間, 到了280 d, 雜交組CJ、JC和自交組 CC、JJ在殼高和殼長上顯著差異(P＜0.05), 雜交組CJ和JC之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.3.2 稚貝, 養成階段存活率的比較分析

各實驗組稚貝在100, 150, 210和280日齡的存活率變化見表6。CC, CJ, JC, JJ 4個實驗組的存活率日齡的增加均呈下降趨勢, 280日齡時各實驗組存活率分別為34.4, 12.2, 1.1, 1.1%。在整個稚貝, 養成期,CC組存活率最高, 其次是CJ組和JJ組, JC組存活率最低。JC組和 JJ組之間無顯著差異(P＞0.05), 但與CC組, CJ組之間差異顯著(P＜0.05)。

表5 稚貝, 養成期各實驗組稚貝的生長Tab. 5 Growth of the four groups at spat and adult stage (mm)

表6 稚貝, 養成期各實驗組稚貝的存活率Tab. 6 Percent survival means of the four groups at spat and adult stage (%)

2.3.3 稚貝, 養成階段雜種優勢率的比較分析

表7 稚貝, 養成期各雜交組生長和存活的雜種優勢率Tab. 7 Heterosis for growth and survival of the four groups at spat and adult stage

稚貝, 養成期, 雜交組生長和存活的雜種優勢率見表 7。同自交組相比, 雜交組 JC在殼高、殼長上均具有雜種優勢, 并且雜交組JC在殼高上的雜種優勢率隨著日齡的增加而增加(1.12%～13.80%), 殼長的雜種優勢率亦是如此(1.55%～17.03%); 而JC在存活率方面的不具有雜種優勢。雜交組CJ在殼高、殼長和存活率上都不具有雜種優勢率。

3 討論

雜種優勢是雜種子一代在生長力、繁殖力、產量、品質等性狀上優于雙親的一種復雜的生物學現象。雜種優勢的大小, 大多取決于雙親性狀間的相對差異和互補程度。在一定范圍內, 雙親的差異越大,往往雜種優勢越強; 反之, 越弱。本實驗中采用的兩個長牡蠣群體, 是中國群體2007年群體選育F1子代與日本群體2007年群體選育F1子代, 兩個群體來自不同的地點, 長期的養殖環境差異, 加上各自為群體選育 F1子代, 經過了以生長率、體長和體重為指標的連續歧化選擇, 這些因素必然導致期遺傳上存在差異。因此, 利用中、日兩個長牡蠣群體進行雜交有可能產生較大的雜種優勢。

本研究發現, 4個實驗組的受精率為 76.76%～91.33%, 經方差分析表明, 雜交組與自交組之間無顯著差異; 4個實驗組的孵化率為71.25%～96.00%, 其中CJ組的孵化率最低, 為 71.25%, JJ組的孵化率最高,為 96.00%, 相同卵子來源的組合在孵化率上無差異,即CC組與CJ組之間, JC組與JJ組之間無顯著差異。這些結果表明了長牡蠣中國群體和日本群體雜交的可行性。其主要原因是中國長牡蠣群體與日本長牡蠣群體之間的親緣關系較近, 雙親異性配子之間的親和力較高, 因此正、反雜交的受精率均很高。

本實驗中, 雜交組JC在幼蟲期的各項形態指標(殼高、殼長和存活率)均表現出明顯的雜種優勢, 其幼蟲階段殼高、殼長和存活率的雜種優勢率分別為0.85%～5.63%, 0.29%～8.64%, 12.31%～96.45%; 到了稚貝養成階段, JC在殼高和殼長上仍具有明顯的雜種優勢, 殼高和殼長的雜種優勢率分別為 1.12%～13.80%, 1.55%～17.03%。雜交后代在生長存活等方面表現出一定的雜種優勢在其他水產動物的雜交實驗中也同樣得到證實。例如, Newkirk[17]的研究發現長牡蠣 4個群體雜交后代在生長性狀和存活率方面明顯高于親本。Rahman等[20]對兩種海膽進行雜交, 結果發現雜交組12月齡的平均體重比自交組分別增加51.7%和48.4%。

雖然本實驗中, 雜交組JC在幼蟲期的各項形態指標上和稚貝養成期的殼高、殼長這些生長性狀上表現出明顯的雜種優勢, 但是在稚貝養成期的存活率上卻表現出了不同的現象, 雜種優勢為負值, 而雜交組CJ在幼蟲期和稚貝養成期的各項形態指標上都沒有表現出雜種優勢。這種不同的生長階段表現出不同的雜種優勢率, 以及正、反雜交后代在雜種優勢上具有不同表現的現象在其他水產動物雜交實驗中也有發現。Zhang等[15]對海灣扇貝不同群體(M和C)進行雜交, 結果發現, 幼蟲階段, 雜交組MC生長最快; 到了稚貝養成階段, 雜交組 CM 超過 MC, 在殼高、殼長和總重這些生長指標上表現最好。Zheng等[21]在海灣扇貝不同地理群體(A和B)雜交效果研究中發現群體 A在幼蟲、稚貝以及成貝都獲得了較高的雜種優勢率, 而群體 B的雜種優勢率在各階段均為負值。正、反雜交后代在雜種優勢上具有不同表現, 其主要原因是環境和遺傳因素的共同作用[22]。在幼蟲期, 由于室內培育的原因, 水質、水溫、餌料等因素保持在較適宜的條件下, 水中敵害生物較少,這時幼蟲的存活率高低主要取決于幼蟲本身的遺傳特性。長牡蠣日本群體為選擇育種 F1代, 經過一代選擇, 各種生長性狀優良, 遺傳基礎優秀, 而且在生物早期階段的生長與發育中, 母體效應是一個非常重要的影響因素, 因而在幼蟲期JJ和JC組的殼高、殼長生長較快, 存活率較高; 而長牡蠣中國群體取自威海乳山, 在中國養殖了多年, 種質出現退化, 遺傳特質上不如長牡蠣日本群體, 因而CC和CJ組生長緩慢, 存活率較低。到了稚貝及養成期, 海上養殖的環境條件不可控, 水溫、水質、餌料, 敵害等環境因子隨著季節變化而變化, 使得環境條件對長牡蠣存活的影響非常大, 長牡蠣中國群體有可能更適應中國水域的變化情況, 加上母體效應即使成體之后依然存在的緣故[19], 因而使得CC和CJ的存活率較高, JJ和JC的存活率反而較低。

本實驗通過對長牡蠣群體雜交的受精情況和雜種優勢分析, 揭示了長牡蠣日本群體♀×中國群體♂的雜交子代在生長性狀方面具有顯著的雜種優勢。所以, 應用這兩個群體進行雜交以改良現有養殖群體可能是一個有效的途徑。

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