馬氏珠母貝家系遺傳結構的微衛星分析

湯 健 , 管云雁, 劉文廣, 何毛賢

(1. 中國科學院大學, 北京 100039; 2. 中國科學院 南海海洋研究所, 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室, 廣東 廣州 510301)

馬氏珠母貝(Pinctada fucata), 又稱合浦珠母貝,主要分布于太平洋西南部, 是世界上培育海水珍珠的主要種類。在中國主要分布于廣東、廣西、海南和臺灣海峽南部一帶, 是中國海水珍珠養殖的主要品種。我國自1965年成功開展其人工育苗以來, 經多年養殖的馬氏珠母貝的性狀已呈現明顯退化現象,盲目引種雜交給馬氏珠母貝種質帶來不同程度的影響, 具體表現為遺傳力減弱、抗逆性差、成活率下降、性狀退化等嚴重問題[1]。因此對馬氏珠母貝進行遺傳改良, 培育出生長快、個體大、育珠性狀好的品種,是當前珍珠養殖業的重要課題。利用DNA分子標記可顯著促進海洋生物資源保護和遺傳改良工作的實施, 為遺傳育種提供理論依據和指導[2-4]。目前, 中國已有科技工作者采用多種遺傳標記對不同的馬氏珠母貝野生種群、養殖種群及育種群體進行了遺傳多樣性和遺傳變異的研究, 如RAPD[5-6]、ISSR[7-8]、AFLP[9-10]、 SSR[11-12]等, 然而利用DNA分子標記進行家系遺傳研究還很少見到報道[13]。通過家系選育獲得新的品系或品種, 對于馬氏珠母貝優良品種的培育具有重要的意義。

微衛星(microsatellite), 又稱簡單序列重復(SSR,simple sequence repeat), 是2～6個堿基串聯重復序列,廣泛分布于真核生物基因組中[14-15]。微衛星由于分布隨機廣泛(包括編碼區和非編碼區), 多態性高, 符合孟德爾遺傳, 可區分純合子和雜合子表現共顯性,適于操作等特點, 是近年來迅速發展起來的第二代DNA多態分子標記之一[16-17], 現已被廣泛應用于水產經濟品種的種質鑒定、遺傳育種等研究領域[18-20]。本研究利用6個微衛星位點對9個馬氏珠母貝家系進行了遺傳分析, 以期獲得9個家系的遺傳多樣性水平、遺傳結構及可能與生長的關系, 為馬氏珠母貝的育種選配方案提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

用于本研究的馬氏珠母貝Pinctada fucata家系構建于 2008年并養殖于深圳大鵬澳海區, 編號F1～F12, 其中F1、F8和F10因臺風災害丟失,家系構建方法見湯健等[21]。從每個家系隨機取樣48個個體,取其閉殼肌組織于95%酒精中保存待用。取50～100 mg閉殼肌組織, 純水漂洗后使用北京天根公司提供的海洋動物組織基因組提取試劑盒(QIAGEN Marine Animals DNA Kit)提取基因組DNA。DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色檢測, 并測定 260 nm和280 nm處吸光度, 檢測DNA的質量和計算濃度, 然后配成20 ng/μL的DNA溶液備用。

1.2 微衛星引物篩選及PCR擴增

引物來源于石耀華等[22-23]開發的微衛星標記,共選用 60對引物由生工生物(上海)有限公司合成,通過優化 PCR反應條件, 初步篩選出能夠穩定擴增的引物17對, 選用其中多態性較好的6對引物。引物信息見表1。

PCR 擴增反應總體積為25μL, 其中包括DNA模板 2μL, 10×PCR buffer 2.5μL, dNTP 2μL(2.5μmol/L),上下游引物(10μmol/L)各 1μL, MgCl2(25 mmol/L)1.5～2.0μL, Taq DNA 聚合酶(上海生工)1U, 加 ddH2O補足體系。按各引物條件于BioRad PTC-200 PCR擴增儀上進行擴增。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min,94 ℃ 30 s, 58.5～61 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 2 min, 35 個循環,72 ℃延伸 10 min。

1.3 擴增產物檢測

取PCR擴增產物2μL用10%聚丙烯酰胺凝膠在180 V電壓下電泳分離4～5 h, 電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳完畢后, 使用0.1%硝酸銀溶液染色,顯色液(0.5%氫氧化鈉, 0.4%甲醛, 0.02%硼砂)顯影,掃描儀掃描凝膠成像以記錄實驗結果。

1.4 數據統計與分析

微衛星是共顯性遺傳, 位點可以直接從聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上判讀。統計每個位點的等位基因數量(A), 用Popgene1.32軟件計算每個家系的有效等位基因數(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He),Hardy-Weinberg平衡檢測和Shannon多樣性指數(I), 同時計算了家系間的遺傳距離(D)和遺傳分化指數(FST)。

2 結果與分析

2.1 微衛星位點多態性及家系間遺傳結構分析

圖1 引物在家系部分個體中的擴增結果Fig. 1a The PCR results of SSR primer amplified in some individuals of family

6個微衛星標記在9個馬氏珠母貝家系中均能擴增獲得穩定清晰的條帶, 并在不同家系中表現出不同程度的多態性(圖1)。9個家系的平均等位基因數(A)、平均有效等位基因數(Ne)、平均期望雜合度(He)、平均觀察雜合度(Ho)以及Shannon多樣性指數(I)見表2。6個多態位點共檢測出17個等位基因, 每個位點的等位基因數(A)2～4, 其中位點HNUPM068檢測出的等位基因最多(4個), 位點HNUPM001、HNUPM004的等位基因最少(2個), F3、F5、F7和F12的A最高(3.333),F2的A最少(2.833); 9個家系的有效等位基因數(Ne)為2.030～2.632, 平均觀測雜合度(Ho)為0.4306～0.6354,平均期望雜合度(He)為0.4380～0.5962, Shannon多樣性指數(I)為0.7539～1.003; F6的He最高, 為0.5962, F9最低, 為0.438; F6具有最高的I值(1.003), F9最低(0.7539)。

表2 6個SSR位點在9個馬氏珠母貝家系中的統計總結Tab. 2 Statistics of 6 microsatellite loci among nine families of Pinctada fucata

Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗發現, 6個多態位點中, F4有1個位點偏離平衡狀態, F2、F5和F9各有2個位點偏離平衡狀態, F3、F6、F7和F11各有3個位點偏離遺傳平衡狀態(P＜0.05)。Hardy-Weinberg平衡指數(d)為-0.1573～0.1496。在9個家系中, 4個家系(F3、F4、F5和F7)表現為雜合子過剩(d＞0), 其余家系(F2、F6、F9、F11和 F12)均表現為雜合子缺失(d＜0)。

2.2 家系間遺傳分化比較

分析結果顯示, 各位點上 9家系間遺傳分化系數FST為 0.0375～0.2733, 均值為 0.0749。發現有 4個位點FST小于0.05, 剩下兩個位點的FST大于種群間無遺傳分化的標準(FST=0～0.05)[24]。根據 Nei[25]計算9個家系的遺傳距離和遺傳相似性指數(表3), 結果顯示F7和F9遺傳距離最近(0.0202), 遺傳相似性指數最高(0.9800); F11和F12遺傳距離最遠(0.2776),相似性指數最低(0.7576)。

表3 9個馬氏珠母貝家系間的遺傳距離及相似性指數Tab. 3 Genetic distances and similarity index among nine families of Pinctada fucata

利用軟件MEGA 3.0, 根據遺傳距離采用NJ法進行聚類分析。結果如圖2所示, 聚類樹分為明顯的兩支。F7和F9首先聚類, 再分別與F11、F4聚類, 然后與F2、F3相聚; 另一支F6和F12相聚后與F5相聚, 最后兩支聚到一起。

圖2 9個馬氏珠母貝家系的NJ系統樹Fig.2 NJ tree of nine families of Pinctada fucata

3 討論

3.1 馬氏珠母貝家系多樣性水平及遺傳差異分析

本研究中9個馬氏珠母貝家系的觀測雜合度為0.4306～0.6354, 期望雜合度為0.4380～0.5964, 所選6個位點的雜合度皆高于這些標記所分析的兩個地理種群[26]。根據已有的文獻報道[12-13,27-28], 微衛星標記分析的馬氏珠母貝養殖群體的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.15～0.56和0.38～0.75, 與之相比, 本研究中的9個家系的觀測雜合度處于中等偏上的水平, 期望雜合度處于中等水平。9個家系中, 其中有5個家系(F2、F6、F9、F11和F12)表現為雜合子缺失, 說明近交機會增大使得這些家系遺傳多樣性正在逐漸變小,進而造成純合子增多、雜合子減少, 部分等位基因喪失。F4是一個自交家系, 其有效等位基因數最少,Ne和No也較低, 說明自交會使其遺傳多樣性降低。張紅玉等[13]使用SRAP分子標記分析也表明馬氏珠母貝家系的遺傳多樣性隨世代的增加而有下降的趨勢, 在羅非魚、中國對蝦的群體選育中也有相似的現象[29-30],連續的封閉群體自交會引起遺傳多樣性的下降。雖然一些研究表明雜交能提高后代的雜合度[31], 但由于本研究中其他3個自交家系丟失, 家系間雜交能否增加雜合度, 從而改善生長性能難以得到證實。

卡方檢驗Hardy-Weinberg平衡結果表明所檢測的6個位點的基因型在群體中的分布均極顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡, 說明群體內的基因型頻率發生了很大改變, 這與突變、雜交、選擇等因素有關,與家系培育中親本數量少也有很大的關系, 有限的親本數量會引起養殖群體的遺傳結構發生改變, 導致群體的隨機漂變或瓶頸效應[32-33]。遺傳分化的本質是基因頻率的變化和雜合度變化, 是雜合度與一致度的度量。遺傳分化系數FST能夠反映各個家系間的分化水平, 本研究中各座位的FST均值為0.0749,表明各個家系間存在中度遺傳分化, 9個家系僅有7.49%的變異是由群體間分化導致的, 而92.51%的變異來源于群體內。其中位點HNUMP068、HNUM125、HNUMP129和HNUMP146表現出極顯著差異(P＜0.05), 表明這4個位點在不同家系中的分布不均衡, 該結果與卡方檢驗Hardy-Weinberg平衡結果得出的結論一致。

3.2 家系雜交組合策略及雜種優勢分析

家系選育在水產經濟種類育種中具有重要地位,通過家系選育進行不斷遺傳改進, 可以使經濟性狀得到改進。家系的建立和選育是否成功關鍵在于親本的選擇, 根據傳統育種經驗如親本性狀互補, 親緣關系及地理距離遠近等, 作為親本選配的原則,準確性較小, 很難達到預期目的。分子標記能夠直接反映親本家系間基因組水平上的遺傳差異, 通過分子標記遺傳距離能夠在一定程度上預測生物的雜種優勢, 一些研究表明遺傳距離與雜種優勢呈顯著正相關[34], 而且親本的遺傳距離越遠, 其交配產生雜種優勢就越明顯[35]。本研究中, 9個家系的分子聚類關系樹形成明顯的2支, 在后續的家系選育中可以優先利用遺傳距離最遠且生長速率較快的F11家系與F12家系(見備注2)進行雜交, 以期獲得較好的雜種優勢; F11 生長快, 雜合度較低, 可通過自交以期培育出遺傳穩定的優良家系。

9個家系中雜合度較高的家系, 親本中出現F12的頻率最高, 其次F19, 再次F14, 最次F17。從子代各家系的生長速率來看, 以F17為親本的家系各數量性狀生長速率顯著大于以F19為親本的家系, 這說明親本F17的后代已經具備優良性狀的穩定遺傳。特別是子代F11, 可對其進一步培育, 獲得具有能夠穩定遺傳優良性狀的后代, 形成優良品種。

研究中發現, 一些微衛星位點的出現頻率與親本雜交方式以及子代雜交優勢存在一定程度聯系。如具有相同親本的正反交子代F2與F6, F9與F11在一些座位上, 各基因型出現頻率大體相似, 并且除F2與F6在殼寬生長速率外各數量性狀生長速率差異不顯著; 而F2與F6相比, 在HNUMP004座位上表現出雜合子缺失, AA型基因富集較為嚴重(共計出現31次)。有相同親本的正反交子代F3與F12在體質量生長速率上存在顯著差異(P＜0.05), 而F3在HNUMP001座位上, AA基因型出現15次, AB基因型出現33次, F12在此座位上, AA基因型出現34次, AB基因型出現14次, 其他性狀生長速率差異不顯著。這表明雜交子代只在個別數量性狀有雜種優勢, 獲得雜種優勢的程度與親本的選擇和雜交組合方式有關,這與王愛民等[31]研究結果一致。并且雜種優勢和親本雜交組合方式在子代基因型的出現頻率上能夠得到一定程度的反映。用最小二乘法對標記座位與馬氏珠母貝生長速率進行連鎖顯著性檢驗, 未發現有與數量性狀的生長速率顯著相關的基因座位, 這可能與所選用的微衛星標記數量較少有關。

3.3 引物篩選過程中出現的問題分析

本研究在微衛星引物篩選的過程中遇到了較大困難, 從文獻中引用的 EST-SSR, 大部分難以擴增出穩定清晰的條帶, 在反復優化 PCR反應條件的過程中, 一些引物在提高退火溫度之后, 能夠得到穩定的擴增條帶, 但擴增條帶呈單態。根據引物篩選的電泳圖譜, 觀察條帶是否清晰和檢測位點是否多態來確定引物是否可用。在文獻報道的退火溫度基礎上適當擴大范圍采用梯度PCR以摸索最適溫度和調整Mg2+濃度。最后只篩選出17對能夠穩定擴增的引物, 其中具有多態性的引物僅6對。本實驗室在研究一個野生群體和四個養殖群體的遺傳多樣性也使用了部分相同的引物, 同樣只有17對能夠穩定擴增條帶的引物, 但多態性明顯好于該研究中的 9個家系,不過仍低于文獻的報道[23,26]。其原因可能在于, 供試群體來源于不同地理群體, 其種群的遺傳背景存在較大的差異, 而且不同地理群體經過多年封閉養殖,由于人工育苗時采用較少數量的親貝, 甚至在生產過程中重復使用養殖貝作為親貝, 累代繁殖過程中高強度人工選育以及近交等因素, 使得養殖群體遺傳多樣性降低, 微衛星位點表現為雜合子缺失, 某些位點少數等位基因的富集較為嚴重, 稀有等位基因大量丟失。這種明顯的非目的性人為選擇趨向, 對種質資源的保護和持續利用是極為不利的。

致謝: 家系材料構建在中國科學院大亞灣海洋生物綜合實驗站完成。

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