粵東養(yǎng)殖區(qū)分離的2株海洋弧菌及其胞外產(chǎn)物對(duì)皺紋盤(pán)鮑致死毒性的初步分析

房沙沙, 林壯炳, 邱 礽, 王劭雯, 劉 曉

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東青島266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100039; 3. 廣東省汕頭市水產(chǎn)技術(shù)推廣中心站, 廣東汕頭515041)

皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannai)自然分布于我國(guó)遼東和山東半島水域[1], 是重要的海水養(yǎng)殖貝類(lèi)。我國(guó)從20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始皺紋盤(pán)鮑人工養(yǎng)殖,主要養(yǎng)殖區(qū)在遼東半島、山東半島及福建北部和中部沿海。近30年來(lái), 皺紋盤(pán)鮑養(yǎng)殖區(qū)域和規(guī)模增長(zhǎng)迅速, 目前, 遼寧、山東、浙江、福建、廣東等省沿海海域均有皺紋盤(pán)鮑養(yǎng)殖。

2011年秋季以來(lái), 福建和廣東東部養(yǎng)殖的皺紋盤(pán)鮑發(fā)生流行性病害, 培育的鮑苗死亡情況尤其嚴(yán)重。2011年12月初, 我們從廣東汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司采集 2月齡患病幼鮑, 從中分離純化得到兩株細(xì)菌, 菌株編號(hào)分別為bb3和bb4, 回歸感染實(shí)驗(yàn)表明, 菌株bb3和bb4均可致皺紋盤(pán)鮑死亡且可從接種死亡的受試鮑中重新分離得到。經(jīng)16S rRNA序列分析初步鑒定此 2株細(xì)菌均為弧菌; 經(jīng) topA,ftsZ, gapA, mreB, gyrB, pyrH, recA等管家基因的序列分析進(jìn)一步明確 bb3為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4為哈氏弧菌(V. harveyi)[2]。

為明確溶藻弧菌bb3、哈氏弧菌bb4與我國(guó)南方皺紋盤(pán)鮑流行性病害的關(guān)系, 我們開(kāi)展了一系列的研究工作。本文報(bào)道該 2株弧菌及其胞外產(chǎn)物對(duì)皺紋盤(pán)鮑的致死效應(yīng)、侵染途徑及對(duì)抗生素的敏感性等研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 弧菌菌株

本研究使用的2株弧菌于2011年12月從汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司的 2月齡患病幼鮑中分離得到, 菌株bb3為溶藻弧菌、bb4為哈氏弧菌[2]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

供試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為我們培育的皺紋盤(pán)鮑“97”選育群體第5代。2011年4月24日在榮成億祥水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司鮑育苗室繁育, 10月將部分苗種送到青島潤(rùn)海海珍品養(yǎng)殖公司的鮑越冬車(chē)間養(yǎng)殖。越冬期間水溫 10～15℃, 投喂人工配合餌料, 日常管理按常規(guī)生產(chǎn)方法進(jìn)行。2012年 3月, 供試幼鮑轉(zhuǎn)移到中國(guó)科學(xué)院海洋研究所培育樓暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間, 培育水溫20℃, 投喂鹽漬海帶, 每天清理糞便、殘餌并全量換水1次。

2012年4月, 從暫養(yǎng)的幼鮑中取3種規(guī)格個(gè)體用于本研究, 其中A組(殼長(zhǎng)35.5 mm±0.9 mm、全濕重 5.58 g±0.48 g)和 C 組(殼長(zhǎng) 24.5 mm±0.8 mm、全濕重1.84 g±0.11 g)用于比較幼鮑對(duì)弧菌的敏感性差異; 其他實(shí)驗(yàn)均采用B組(殼長(zhǎng)31.2 mm±1.4 mm、全濕重 4.01 g±0.54 g)幼鮑。

侵染實(shí)驗(yàn)之前, 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求選取所需幼鮑,隨機(jī)分組備用。侵染處理結(jié)束后, 繼續(xù)在 20℃自然海水中培育, 每天2次清理、統(tǒng)計(jì)死亡幼鮑。

1.2 侵染實(shí)驗(yàn)

1.2.1 弧菌懸浮液及胞外產(chǎn)物粗提液制備

弧菌懸液制備: 從LB平板上挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中, 在28℃, 160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10～12 h后離心收集細(xì)菌, 用無(wú)菌PBS洗滌5遍。用PBS懸浮后在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)菌懸浮液的OD值(A), 按預(yù)實(shí)驗(yàn)稀釋平板計(jì)數(shù)法標(biāo)定的每 1.0 OD懸浮液的弧菌濃度[2](bb3: 12.4×108cfu/mL; bb4:10.0×108cfu/mL)調(diào)整到侵染實(shí)驗(yàn)所需濃度。弧菌懸液制備后立即進(jìn)行注射處理。

胞外產(chǎn)物粗提液制備: 參考文獻(xiàn)[3-4]的方法略有改動(dòng), 在LB固體培養(yǎng)基表面覆蓋1層無(wú)菌玻璃紙,取100 μL供試菌的菌液均勻涂布于滅菌玻璃紙上培養(yǎng)過(guò)夜, 每個(gè)菌株鋪4～5個(gè)平板。每個(gè)平板用2 mL PBS洗下玻璃紙上生長(zhǎng)的弧菌, 小心轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中, 于4℃、8 500 r/min離心30 min, 取上清, 經(jīng)孔徑0.22 μm的纖維素膜過(guò)濾, 所得濾液即為相應(yīng)菌株的胞外產(chǎn)物粗提液。

1.2.2 弧菌對(duì)皺紋盤(pán)鮑的致死效應(yīng)研究

弧菌及其胞外產(chǎn)物的侵染實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所培育樓進(jìn)行。侵染實(shí)驗(yàn)共采用注射、創(chuàng)傷-浸浴和取食等3種方法。侵染實(shí)驗(yàn)全程在20℃進(jìn)行,期間投喂餌料、清理糞便、換水等均采用常規(guī)方法。

注射: 本研究供試幼鮑及注射用弧菌懸液的濃度如表1所示。幼鮑陰干10～15 min后往每個(gè)供試幼鮑腹足中部的肌肉組織注射100 μL當(dāng)天制備的弧菌懸浮液, 對(duì)照組注射相同體積的 PBS溶液。每個(gè)幼鮑的注射位置、深度基本接近。注射處理后約10 min,將受試幼鮑置于自然海水中培育。每處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)各注射30個(gè)幼鮑。

表1 注射侵染的分組和處理情況Tab.1 The infection experiment by intramuscular injection

創(chuàng)傷-浸浴:(1)創(chuàng)傷-浸浴處理組: 用1 mL一次性無(wú)菌注射器的針頭刺入供試幼鮑的腹足部, 深度約2 mm, 每個(gè)供試鮑處理2次, 經(jīng)創(chuàng)傷處理后, 將幼鮑放入到弧菌濃度為1.0×108cfu/mL的海水中再進(jìn)行浸浴處理, 24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育; (2)浸浴處理組: 未經(jīng)創(chuàng)傷處理的幼鮑在含弧菌1.0×108cfu/mL的海水中浸浴處理24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育;(3)創(chuàng)傷對(duì)照組: 經(jīng)過(guò)創(chuàng)傷處理的幼鮑直接置于自然海水中培育。每處理3次重復(fù), 每個(gè)重復(fù)各30個(gè)幼鮑。

取食: 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在供試的健康幼鮑貝殼上做標(biāo)記并對(duì)供試鮑進(jìn)行為期2 d的饑餓處理。然后將注射 bb4懸液后死亡的幼鮑尸體投入到受試健康鮑的養(yǎng)殖容器中, 12 h內(nèi)將病死鮑尸從養(yǎng)殖容器中移除, 更換新鮮海水后再投入新的剛死亡的幼鮑尸體。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d, 實(shí)驗(yàn)期間不投喂其他餌料。觀察、記錄受試健康鮑對(duì)病死幼鮑軟體部的取食情況并每天2次觀察記錄取食者的死亡現(xiàn)象, 連續(xù)觀察1周。每組實(shí)驗(yàn)含健康鮑和注射弧菌后死亡的一齡鮑各10個(gè)。

1.2.3 弧菌胞外產(chǎn)物粗提液致死毒性的初步研究

為研究供試菌胞外產(chǎn)物的致死毒性, 將胞外產(chǎn)物粗提液分別注射到供試幼鮑腹足部肌肉組織。每處理10個(gè)個(gè)體, 每組2次重復(fù), 對(duì)照組注射PBS溶液。注射處理后按常規(guī)方法管理, 每天2次觀察統(tǒng)計(jì)死亡個(gè)體數(shù)。

1.3 供試弧菌的藥敏試驗(yàn)

選取20種抗生素, 采用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。在每個(gè)LB固體培養(yǎng)基平板上涂布100 μL 濃度為5.0×108cfu/mL的菌液, 然后將藥敏紙片平鋪到培養(yǎng)基表面, 每個(gè)培養(yǎng)皿放置4片藥敏紙片。在28℃培養(yǎng)16 h后測(cè)定抑菌圈直徑, 依據(jù)生產(chǎn)廠家提供的判定標(biāo)準(zhǔn)(http://www.hangwei-media.com/tech1.asp )給出供試菌株對(duì)不同抗生素的敏感性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

某組幼鮑在統(tǒng)計(jì)時(shí)段內(nèi)的死亡個(gè)體數(shù)之和占該組供試鮑總數(shù)的百分比即為該組的累積死亡率, 相同處理的不同重復(fù)組之間的平均值即為該處理組的累積死亡率。采用SPSS16.0軟件中的T檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性, 顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 供試弧菌注射致死的劑量效應(yīng)關(guān)系

取100 μL不同濃度的弧菌懸液注射處理一齡皺紋盤(pán)鮑, 受試鮑的累積死亡率如圖1所示。由圖1可見(jiàn), 受試鮑的累積死亡率隨注射弧菌菌液濃度的增加而升高, 且受試鮑的死亡集中出現(xiàn)在注射處理后的前 8 d, 之后逐漸趨穩(wěn), 2周后未見(jiàn)出現(xiàn)新的死亡(數(shù)據(jù)未列)。注射濃度為 2.5×106、2.5×107、2.5×108cfu/mL的 bb3菌液后, 第14天皺紋盤(pán)鮑的累積死亡率分別是 13.95%、43.33%、78.33%; 注射濃度為2.0×106、2.0×107、2.0×108cfu/mL 的 bb4菌液后, 第 14天皺紋盤(pán)鮑的累積死亡率分別是64.04%、78.02%、94.37%; 在本研究觀察的 2周內(nèi)對(duì)照組的平均累積死亡率為3.33%。上述結(jié)果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4對(duì)皺紋盤(pán)鮑均有致死效應(yīng), 哈氏弧菌bb4的致死毒性強(qiáng)于溶藻弧菌bb3。

2.2 不同規(guī)格皺紋盤(pán)鮑對(duì)溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4的敏感性差異

對(duì)不同規(guī)格皺紋盤(pán)鮑分別注射 100 μL濃度為2.5×107cfu/mL的溶藻弧菌bb3或2.0×107cfu/mL的哈氏弧菌bb4懸浮液, 其中A組平均殼長(zhǎng)35.5 mm±0.9 mm、全濕重5.58 g±0.48 g, 為大規(guī)格組; C組平均殼長(zhǎng)24.5 mm±0.8 mm、全濕重1.84 g±0.11 g, 為小規(guī)格組。注射處理2周后統(tǒng)計(jì)的各組累積死亡率見(jiàn)圖2。溶藻弧菌bb3侵染處理后, A組幼鮑的累積死亡率為20.00%, C組為58.89%, T檢驗(yàn)結(jié)果顯示A組與C組的死亡率差異顯著(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4侵染處理后, A、C組受試鮑在2周時(shí)的累積死亡率分別為35.56%和 71.11%, 差異顯著(P＜0.05)。本研究的結(jié)果表明, 受試鮑對(duì)病原弧菌的敏感性與個(gè)體規(guī)格相關(guān), 體重小者對(duì)病原弧菌更敏感。因此, 我們?cè)诤罄m(xù)有關(guān)病原-宿主相互作用的研究中盡量選用規(guī)格接近的鮑作為受試對(duì)象。

圖1 不同劑量弧菌懸浮液注射后幼鮑死亡率隨培育時(shí)間的變化曲線Fig. 1 Cumulative mortality of juvenile abalones after vibrio challenging

2.3 供試弧菌對(duì)皺紋盤(pán)鮑侵染途徑的初步分析

2.3.1 創(chuàng)傷-浸浴侵染

經(jīng)創(chuàng)傷處理或不經(jīng)創(chuàng)傷處理的皺紋盤(pán)鮑分別在含1.0×108cfu/mL的bb3或bb4弧菌懸浮液中浸浴24 h后轉(zhuǎn)移到自然海水中培育2周。創(chuàng)傷對(duì)照組經(jīng)相同創(chuàng)傷處理但不進(jìn)行弧菌浸浴, 2周后統(tǒng)計(jì)各處理組的死亡率, 結(jié)果見(jiàn)表2。溶藻弧菌bb3的創(chuàng)傷-浸浴處理組累積死亡率為 17.78%, 高于單純的浸浴處理組,顯著高于創(chuàng)傷對(duì)照組(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4的創(chuàng)傷-浸浴處理組死亡率為31.11%, 高于浸浴處理組鮑的死亡率為 22.22%, 顯著高于創(chuàng)傷對(duì)照組(P＜0.05)。上述結(jié)果表明, 弧菌懸浮液浸浴可致使受試鮑感染,創(chuàng)傷處理可使受試鮑被病原弧菌侵染的幾率增加,因此, 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中任何減少、滅除特定病原弧菌的管理措施均有望減輕病情, 并且日常管理中應(yīng)盡量避免鮑遭受機(jī)械損傷。

圖2 菌株bb3和bb4對(duì)不同規(guī)格受試鮑的致死毒性Fig. 2 Pathogenicity of vibrio bb3 and bb4 for abalone of different sizes

表2 弧菌創(chuàng)傷-浸浴處理對(duì)受試鮑死亡率的影響Tab. 2 Effects of soaking -wound treatment on cumulative mortality of abalones

2.3.2 攝食感染

在本研究的一組實(shí)驗(yàn)中, 我們觀察到 4個(gè)供試健康鮑啃食因注射哈氏弧菌 bb4懸浮液而死亡的皺紋盤(pán)鮑的軟體部組織, 這4個(gè)取食者在此后的4～7 d內(nèi)相繼死亡, 本研究的初步觀察結(jié)果表明, 同類(lèi)相食可能是鮑病原傳播的途徑之一。圖 3是本研究的部分觀察結(jié)果, 箭頭所指處為皺紋盤(pán)鮑的尸體被啃食后留下的痕跡。

2.4 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4胞外產(chǎn)物粗提液致死毒性的初步研究

利用平板玻璃紙覆蓋法制備弧菌胞外產(chǎn)物粗提液, 對(duì)受試皺紋盤(pán)鮑進(jìn)行足部肌肉注射處理, 每個(gè)受試鮑分別注射溶藻弧菌 bb3或哈氏弧菌 bb4的胞外產(chǎn)物粗提液100 μL, 對(duì)照組注射等量的PBS溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4, 注射處理后次日即發(fā)現(xiàn)有供試鮑死亡, 處理后第6天, bb3胞外產(chǎn)物粗提液注射組累積死亡率達(dá)到60%、bb4處理組死亡率高達(dá)90%, 實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生。本研究的結(jié)果表明, 不僅供試弧菌菌株侵染可導(dǎo)致皺紋盤(pán)鮑死亡, 它們的胞外產(chǎn)物對(duì)受試鮑也同樣具有致死效應(yīng)。但本研究?jī)H進(jìn)行了初步的定性實(shí)驗(yàn), 弧菌胞外產(chǎn)物致死效應(yīng)的劑量效應(yīng)關(guān)系及致死效應(yīng)機(jī)制等均值得深入研究。

圖3 被同類(lèi)啃食過(guò)的幼鮑尸體Fig. 3 Dead abalone bodies bited by other abalones

2.5 供試弧菌的藥敏試驗(yàn)

應(yīng)用紙片法測(cè)定供試弧菌對(duì) 20 種抗生素的敏感性, 結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌 bb4對(duì)頭孢曲松和丁胺卡那霉素均表現(xiàn)出高度敏感性; 此外, 溶藻弧菌bb3對(duì)慶大霉素、復(fù)達(dá)欣、卡那霉素、紅霉素高度敏感; 而哈氏弧菌bb4則對(duì)四環(huán)素和強(qiáng)力霉素高度敏感; 但bb3和bb4卻分別對(duì)8種和11種抗生素表現(xiàn)出抗性, 其中青霉素、氨芐西林、苯唑西林、哌拉西林、羧芐青霉素和先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋辛等8種是2株供試弧菌均具抗藥性的抗生素。

表3 菌株bb3和bb4的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Antibiotic susceptibility tests of bb3 and bb4

3 討論

我國(guó)皺紋盤(pán)鮑和雜色鮑養(yǎng)殖區(qū)均曾發(fā)生大面積的流行性病害, 細(xì)菌[5-7]和病毒[8-10]是歷次流行性死亡的主要病原生物[11], 而海洋弧菌是細(xì)菌性病原中最主要的一個(gè)類(lèi)群。

皺紋盤(pán)鮑的自然分布區(qū)和傳統(tǒng)養(yǎng)殖區(qū)在我國(guó)北方的黃海海域, 我國(guó)皺紋盤(pán)鮑養(yǎng)殖區(qū)自 1992年開(kāi)始曾發(fā)生非常嚴(yán)重的流行性病害, 研究人員先后從病患樣本中分離得到河流弧菌II(V. fluvialisⅡ)[5,12]、坎氏弧菌(V. campbellii)[6]和創(chuàng)傷弧菌(V. vulnificus)[7],侵染實(shí)驗(yàn)表明它們均為皺紋盤(pán)鮑的致病菌。此后,從我國(guó)南方養(yǎng)殖的雜色鮑中陸續(xù)分離得到亮弧菌(V.splendidus)[13]、塔氏弧菌(V. tubiashii)[14]、溶藻弧菌[15-17]、副溶血弧菌(V. paralaemolyticus)[15-16]、霍亂弧菌(V.cholera)[16]、溶珊瑚弧菌(V. coralliiluyitcus)[17]及哈氏弧菌[18-19]等致病性弧菌。本研究從我國(guó)粵東養(yǎng)殖區(qū)分離得到的這2株弧菌分別為溶藻弧菌(bb3)和哈氏弧菌(bb4), 幼鮑被bb3或bb4感染后, 附著力普遍降低, 死亡個(gè)體外套膜收縮、腹足肌肉僵硬并有部分個(gè)體的腹足部出現(xiàn)白色膿皰[2]。侵染實(shí)驗(yàn)表明菌株bb3和bb4及其胞外產(chǎn)物在20℃水溫下對(duì)1齡皺紋盤(pán)鮑表現(xiàn)出較強(qiáng)的致死毒性, 它們對(duì)皺紋盤(pán)鮑的致死毒性與弧菌濃度呈正相關(guān)、與皺紋盤(pán)鮑個(gè)體規(guī)格負(fù)相關(guān), 我們的初步結(jié)果表明 bb3和 bb4是皺紋盤(pán)鮑的致病菌, 它們可能是引起2011年秋冬季粵東地區(qū)養(yǎng)殖皺紋盤(pán)鮑大規(guī)模死亡的重要病原菌。

溶藻弧菌和哈氏弧菌此前已從閩粵養(yǎng)殖的雜色鮑中分離得到并被證明是雜色鮑的致病菌[15-19], 同時(shí)溶藻弧菌和哈氏弧菌也是中國(guó)北方養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)植物的常見(jiàn)病原菌, 但以往未見(jiàn)從中國(guó)北方分布或養(yǎng)殖的鮑科動(dòng)物中分離出溶藻弧菌和哈氏弧菌的報(bào)道。本研究所用病原菌分離自廣東汕頭市南弘海珍養(yǎng)殖有限公司的皺紋盤(pán)鮑病患樣本, 該公司所處的汕頭市海門(mén)灣弧菌含量較高, 且以往從該公司養(yǎng)殖的雜色鮑中曾分離到哈氏弧菌, 本研究分離的弧菌菌株與以往從該海區(qū)養(yǎng)殖的雜色鮑中分離的弧菌菌株有哪些異同, 值得進(jìn)一步研究。

鮑以海藻為食, 但在長(zhǎng)期的研究中我們多次觀察到皺紋盤(pán)鮑啃食同類(lèi)尸體的現(xiàn)象。本研究對(duì)皺紋盤(pán)鮑的同類(lèi)相食行為在病害傳播中的作用進(jìn)行了初步研究, 首次觀察到致病海洋弧菌可以通過(guò)宿主被健康鮑取食而傳播給健康個(gè)體, 這可能是鮑病原生物橫向傳播的重要方式之一。因此, 我們建議在鮑人工養(yǎng)殖過(guò)程中及時(shí)清除病死個(gè)體。及時(shí)清除病死個(gè)體不僅可避免尸體腐爛導(dǎo)致養(yǎng)殖水體的水質(zhì)敗壞,而且可切斷病原生物在養(yǎng)殖生物之間的傳播。

本文對(duì)菌株bb3和bb4及其胞外產(chǎn)物的侵染毒性、侵染途徑及對(duì)抗生素的敏感性進(jìn)行了初步研究,結(jié)果已反映出我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)存在的一些現(xiàn)象可能導(dǎo)致的危害, 比如: 對(duì)水產(chǎn)生物異地移養(yǎng)缺乏制約客觀上增加了病害傳播的速度和范圍、并增大了病原生物在物種之間橫向傳播的風(fēng)險(xiǎn); 使用抗生素不規(guī)范導(dǎo)致病原微生物出現(xiàn)耐藥性——在本研究中我們測(cè)試了供試弧菌對(duì)20種抗生素的敏感性, 發(fā)現(xiàn)僅有2種抗生素是這2株弧菌均高度敏感的, 但這2株海洋弧菌同時(shí)表現(xiàn)出抗性的抗生素卻達(dá)到 8種之多。菌株 bb3和 bb4均具備抗藥性的這 8種抗生素分別屬于青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi), 是人類(lèi)醫(yī)學(xué)及畜牧、水產(chǎn)業(yè)中最廣泛使用的2大類(lèi)抗生素。

致謝: 感謝孫黎博士對(duì)本文提出有益建議。

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