兩相體系中固定化黏紅酵母CCZU-G5催化合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯

汪 云 ， 王利群 ，2，何玉財 ，2，朱 劼 ，卿 青 ，王明慧

（1常州大學制藥與生命科學學院，江蘇 常州 213164；2常州市藥品制造與質量控制工程重點實驗室，江蘇 常州 213164）

（R）-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]是合成眾多普利類系列血管緊張肽轉化酶抑制劑（ACEI）類抗高血壓和充血性心力衰竭藥的關鍵手性中間體[1]，其制備方法主要有化學法和生物法[2-7]。其中利用生物催化劑直接對前手性酮進行不對稱還原，理論上可將前體100%轉化為目標產物，是目前高效合成(R)-HPBE的最有效方法之一。

目前，已有不少研究者報道了通過篩選微生物菌株不對稱還原 2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-HPBE，何春茂等[5]篩選出一株對OPBE具有良好還原能力的菌株Bacillus pumilusPhe-C3，在 25 mmol/L的底物濃度下產率達74.5%，e.e.值達97%。Zhang等[2]以Candida kruseiSW2026為催化劑，在底物濃度為12 mmol/L時，獲得的產率和e.e.值分別為 95.1%和 99.7%。由于底物和產物在水中溶解度較低，同時高濃度的底物和產物對細胞具有一定的毒性，因此在水相中微生物對OPBE的催化還原僅能在低濃度下進行，難以達到滿意的催化效果。Shi等[6]用面包酵母為催化劑，研究了在水/苯兩相體系中催化OPBE制備(R)-HPBE，產率和e.e.值分別達到67.1%和96.2%。汪慶等[7]采用固定化細胞催化拆分得到(R)-HPBE，連續轉化 12次后細胞活性未明顯下降。

因此，篩選出具有高立體選擇性還原OPBE微生物菌株及建立合適的生物催化反應體系對于高效合成高光學純(R)-HPBE有著重要的意義。本研究從土壤中篩選出一株對OPBE具有更高催化活性和立體選擇性還原酶微生物菌株，通過將細胞進行固定化并在水/有機溶劑兩相體系中不對稱還原 OPBE合成(R)-HPBE，為生物催化合成(R)-HPBE工業化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，手性柱 OD-H柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），日本 Daicel公司；GC-950氣相色譜儀，上海海欣色譜儀器有限公司；R2ID旋轉蒸發器，鞏義市予化儀器制造有限公司；THZ-072 HT恒溫搖床，上海博彩生物科技有限公司。

2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，純度＞99%，常州武進精細化工有限公司；(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，色譜純，Sigma公司；海藻酸鈉，CP，國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為國產色譜純或分析純。

1.1.2 培養基

（1）富集培養基M1 (g/L) 葡萄糖 1.0，酵母膏 5.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，OPBE 4.0，pH值為7.0。

（2）平板初篩培養基M2 (g/L) 酵母膏 3.0，(NH4)2SO45.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，MgSO40.1，瓊脂20，OPBE 4.0，pH值為7.0。

（3）發酵培養基M3 (g/L) 葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母膏 10，(NH4)2SO42.0，MgSO41.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，pH值為7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

（1）富集培養 取20 g土壤于50 mL無菌水中，搖勻，靜置一段時間，取2 mL于50 mL的富集培養基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養48 h，如此轉接2次。

（2）平板初篩 將上述菌液稀釋105倍后均勻涂布到含一定濃度的OPBE的初篩培養基中，30 ℃恒溫培養2～3天。

（3）發酵培養 將上述平板上長出的單菌落活化后保種，并接到 M3的發酵培養基中發酵培養72 h。

（4）催化反應 將培養好的菌體于4 ℃、8000 r/min離心 10 min，棄上清液，菌體用 PBS（0.1 mol/L，pH =7.0）洗滌兩次后進行催化反應。反應體系包括PBS 5 mL，菌體0.2 g，底物20 mmol/L。

1.2.2 目標菌株的培養

將篩選到的目標菌株發酵液按5% （體積比）的接種量接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養72 h。8000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，0.9%生理鹽水洗滌3次，用于后續的固定化。

1.2.3 細胞固定化方法

將收集的菌體稱取20.0 g懸浮于100 mL的生理鹽水中，攪拌均勻。再加入等體積的 3%海藻酸鈉，充分攪拌混合均勻。用7#注射器吸取上述混合液滴入到2%的CaCl2溶液中，得到直徑為3 mm左右的紅色球狀固定化細胞，鈣化2 h后收集固定化細胞，用生理鹽水洗凈，4 ℃冰箱冷藏備用。1 g濕菌體可得4.5 g固定化細胞（瀝干）。

1.2.4 兩相體系中生物催化還原反應

在 50 mL具塞三角瓶中加入不同體積的 20 mmol/L的Tris-HCl（pH=7.5）緩沖液和有機溶劑（兩相總體積為20 mL），再加入一定量的OPBE，然后加入一定量的固定化細胞和一定量的輔底物，置于搖床中30 ℃，180 r/min下轉化一定時間。4 ℃下8000 r/min離心10 min，取出上層有機相，下層水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥過夜，分析產物的產率和對映體過量值（e.e.）。在固定化細胞重復利用實驗中，反應結束后用生理鹽水洗滌固定化細胞3次，濾紙吸干表面水分后用于下一批次轉化。

1.2.5 分析方法

（1）產率測定 采用氣相色譜檢測，以十二烷為內標物的內標法定量。色譜柱為毛細管柱（25 m×0.25 mm×0.25 μm）。氣相色譜條件：載氣為H2，流量為2.0 mL/min，分流比1∶50，氣化溫度和檢測溫度均為 250 ℃，柱溫 160 ℃保留 1.5 min，以10 ℃/min 升溫至230 ℃維持10 min。

（2）e.e.值測定 采用帶手性柱的高效液相色譜法。流動相正己烷∶異丙醇=95∶5；流速 1 mL/min；柱溫20 ℃；紫外檢測波長225 nm。

產物的產率（Yield）和對映體過量值（e.e.）計算式如式（1）、式（2）。

式中，Ci為底物OPBE 的初始摩爾濃度；CHPBE為反應終止時產物摩爾濃度；AR和AS分別表示R型和S型產物的峰面積。

2 結果與討論

2.1 高選擇性目標菌株的篩選結果

從200份土壤中利用富集培養技術進行篩選，獲得1株編號G5的微生物菌株能夠高立體選擇性不對稱催化還原 20 mmol/L OPBE合成(R)-HPBE（產率76.3%，e.e.值99.2%）。經上海生工生物有限公司測序鑒定該菌為黏紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，命名為Rhodotorula mucilaginosaCCZU-G5。

2.2 有機溶劑的篩選

有機溶劑的存在可以提高轉化體系中底物和產物的溶解度[8]，進而提高產物的產率。實驗考察了OPBE濃度為100 mmol/L轉化體系中不同lgP值有機溶劑（Vaq/Vorg=1/1）對還原反應的影響，結果如表1所示。在lgP值較小的乙酸乙酯、苯、甲苯與水組成的兩相體系中轉化24 h，無產物生成，這可能是由于這些有機溶劑對固定化酵母細胞毒性或抑制作用較大。而在lgP值較大的壬烷和癸烷與水組成的兩相體系中，產率也只能達到65%，這可能是因為底物OPBE在二者中溶解度（數據未給出）較低造成。很明顯，在水/異辛烷兩相體系中產物的產率最高，達72.1%，e.e.值＞99.0%。綜合考慮產物產率和e.e.值，選用水/異辛烷兩相體系為最適的反應體系用于后續的實驗研究。

表1 不同有機溶劑的兩相體系中固定化酵母不對稱還原OPBE的情況

2.3 最適反應時間

兩相體系中不對稱還原的反應時間對反應的產率和 e.e.值影響很大，實驗首先測定了在底物濃度為100 mmol/L，異辛烷比例為50%的水/有機溶劑轉化體系中反應時間對還原反應的影響，如圖 1所示。在水/異辛烷兩相體系中固定化酵母細胞還原OPBE隨著反應時間的延長，產率和e.e.值都逐漸提高，轉化16 h產率和e.e.都維持不變，分別為74.1%和99.5%。因此，最適反應時間為16 h。

2.4 有機溶劑比例對還原反應的影響

兩相反應體系中，提高有機溶劑的比例，底物和產物的溶解度增大，產率也隨之提高，但由于有機溶劑對細胞的毒害作用，有機溶劑比例過高也會導致產率下降[9-10]。本研究進一步考察了不同體積比（5%～60%）異辛烷對轉化(R)-HPBE的影響，結果如圖2所示，當異辛烷含量為10%時，產物的產率較高，為83.2%，繼續提高有機溶劑比例，產率下降，有機溶劑的比例對反應的 e.e.值無明顯影響。這與Reku?等[11]闡述的結果一致。故本實驗選擇 10%異辛烷作為水/有機溶劑兩相反應體系進行后續研究。

2.5 不同輔底物對還原反應的影響

絕大多數全細胞的不對稱催化需要有輔酶再生體系與還原反應耦合，以維持反應的進行[10]。不同的輔底物對生物轉化反應的效果不同。在底物濃度為100 mmol/L，10%異辛烷的水/有機溶劑兩相體系中，以未添加輔助底物為對照，考察了添加6種不同輔底物（乙醇、異丙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖）對還原反應的影響（表2）。由表2可知，不同的輔助底物對反應的影響較大。其中添加葡萄糖作為輔底物時，產率達到最大。在此基礎上，進一步考察了10～70 g/L的不同葡萄糖濃度對還原反應的影響，結果如圖3所示，隨著葡萄糖濃度的增加，產率逐漸上升；當葡萄糖含量達到40 g/L時，產率達到最高，繼續增大葡萄糖的濃度，產率沒有明顯提高，而葡萄糖濃度對整個反應的e.e.值影響不大，均保持在 99%以上。綜合考慮成本與來源因素，選擇 40 g/L 葡萄糖輔作為輔底物用于后續實驗的研究。

2.6 初始底物濃度對還原反應的影響

對于生物催化而言，反應體系中不同初始濃度的底物對微生物催化的不對稱還原反應有一定影響[12]。本研究考察了不同初始OPBE濃度（50～200 mmol/L）對還原反應的影響，結果如圖4所示。在兩相體系中反應16 h，底物濃度對產物的e.e.值影響不大。當底物濃度為50 mmol/L時，產率為96.5%。隨著底物濃度的增加，產物的產率逐漸降低，當底物濃度為100 mmol/L和200 mmol/L時，產率分別為 83.3%和 44.0%，這說明底物對生物催化劑有一定的抑制作用。然而，Rhodotorula mucilaginosaCCZU-G5 催化活性明顯比文獻[2，5-6，13]報道的結果要高，可見固定化黏紅酵母在合成(R)-HPBE中有著潛在的應用前景。

表2 不同輔助底物對OPBE不對稱還原(R)-HPBE反應的影響

2.7 固定化催化劑用量對還原反應的影響

生物催化體系中，催化劑用量對還原反應有直接影響[14]。本研究分別考察了在100 mmol/L的底物濃度下不同用量的固定化細胞（0.2～0.5 g/mL）對還原反應的影響，結果見圖5。從圖5可以看出，隨著催化劑用量的增加，產物的產率增加，在0.45 g/mL固定化酵母細胞作用下產率達到83.5%，繼續提高催化劑用量產率不再增加。固定化細胞用量的改變對 e.e.值影響不大，維持在 99%以上。因此，固定化細胞最適添加量為0.45 g/mL。

2.8 固定化細胞重復利用次數對還原反應的影響

在優化上述反應條件的基礎上，考察 100 mmol/L底物濃度下固定化細胞重復利用次數對于還原反應的影響。為了維持固定化細胞的機械強度，在多批次轉化過程中加入0.05%的CaCl2（未加時固定化細胞有明顯的吸脹），結果見圖6。從圖6可知，固定化細胞穩定性較好，隨著轉化次數的增多，產率下降的幅度較小，在第7個周期后產率還維持在70%以上，至第8個周期開始顯著下降。固定化細胞的重復利用對產物的 e.e.值影響不大，均維持在99%以上，說明固定化細胞穩定性較好。

3 結 論

從土樣中篩選得到一株能高效催化OPBE不對稱還原合成(R)-HPBE的菌株，并鑒定為黏紅酵母，通過將細胞進行固定化并在水/有機溶劑兩相體系中不對稱還原OPBE合成(R)-HPBE，研究得到以下結論。

（1）不同的有機溶劑對還原反應有著顯著的影響，lgP在3.5以上的有機溶中，用水/異辛烷組成的兩相體系可以獲得較好的催化效果。

（2）兩相體系中有機溶劑的比例、初始底物濃度、輔助底物的種類和濃度以及催化劑用量對還原反應也有顯著的影響，當初始底物濃度為 100 mmol/L，在含10%異辛烷、輔底物葡萄糖40 g/L、催化劑用量0.45 g/mL的兩相體系中反應16 h，產率為83%。另外，上述條件對反應的e.e.值影響不大，均維持在 99%以上。這比之前報道的所有在單水相和兩相體系中所獲得的產率和光學純度都要高。

（3）兩相體系中固定化細胞可重復 7次，產率和e.e.值都維持在較高水平，穩定性較好。

[1]Urbach H，Henning R.A favorable diastereoselective synthesis ofN-(1-S-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-S-alanine[J].Tetrahedron Letters，1984，25（11）：1143-1146.

[2]Zhang W，Ni Y，Sun ZH，et al.Biocatalytic synthesis of ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate withCandida kruseiSW2026：A practical process for high enantiopurity and product titer[J].Process Biochemistry，2009，44（11）：1270-1275.

[3]王利群，汪慶，何玉財，等.一株脂肪酶產生菌及其脂肪酶催化性質的初步研究[J].化工進展，2012，31（3）：643-648.

[4]Lacerda P S B，Ribeiro J B，Leite S G F，et al.Microbial enantioselective reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate[J].Biochem.Eng.J.，2006，28（3）：299-302.

[5]何春茂，常東亮，張杰.生物催化不對稱還原法制備(R)-和(S)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[J].精細化工，2008，25（7）：720-723.

[6]Shi Y G，Fang Y，Wu H P，et al.Asymmetric reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate with Baker’s yeast in water/organic biphasic system[J].Journal of Biotechnology，2008，136：S361.

[7]汪慶，王利群，何玉財，等.固定化沙雷氏菌脂肪酶拆分(R，S)-2羥基-4-苯基丁酸乙酯[J].精細化工，2012，29（3）：250-253，307.

[8]León R，Fernandes P，Pinheiro H M，et al.Whole-cell biocatalysis in organic media[J].Enzyme Microb.Technol.，1998，23（7-8）：483-500.

[9]薛穎，張芳，王旻，等.兩相體系中固定化生物合成(S)-3,5-雙三氟甲基苯乙醇[J].中國醫藥工業雜志，2009，40（8）：573-577.

[10]Kataoka M，Bohani L P S，Wada M，et al.Escherichia colitransformant expressing the glucose dehydrogenase gene fromBacillus megateriumas a cofactor regenerator in a chiral alcohol production system[J].Biosci.Biotechuol.Biochem.，1998，62（1）：167-169.

[11]Reku? A，Jastrzembska B，Liesiene J，et al.Comparative studies on immobilized laccase behaviour in packed-bed and batch reactors[J].J.Mol.Catal.B：Enzym.，2009，57（1-4）：216-223.

[12]Nakamura K，Kawai Y，Nakajima N，et al.Stereochemical control of microbial reduction 17：A method for controlling the enantioselectivity of reductions with Baker’s yeast [J].J.Org.Chem.，1991，56（15）：4778-4783.

[13]李泳寧，石賢愛，孟春，等.非水相固定化酵母催化的(S)-2-辛醇的不對稱合成[J].藥用生物技術，2006，13（6）：446-450.

[14]楊錦，方世銀，石賢愛.水相中釀酒酵母催化 3-氯-1-苯丙酮的不對稱還原反應[J].過程工程學報，2011，11（2）：324-328.