白細胞介素17在大鼠纖維化模型中的作用及意義＊

鮑文華，穆曉春，顧少巖，孫云暉，閻紅娥（.佳木斯大學附屬第一醫院呼吸內科，黑龍江佳木斯 5400；.黑龍江省齊齊哈爾市第一醫院呼吸內科 6000）

肺間質纖維化（IPF）是多種病因引起的異質性疾病，病變局限于肺部，組織病理學和（或）影像學表現具有普通型間質性肺炎（UIP）的特征［1］。本實驗用博來霉素制備肺纖維化動物模型，通過檢測白細胞介素17（IL－17）含量的變化，從而進一步探討IPF的發病機制，為早期診斷及治療提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SD大鼠64只，體質量（240±20）g，清潔級，大連醫科大學實驗動物中心提供；動物合格證號ISCXK（遼）2008－0002，按清潔級標準正常飼養。

1.1.2 主要實驗試劑 注射用鹽酸博來霉素，15毫克／支，日本化藥株式會社生產；IL－17酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均由天津市金圣生物試劑公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和模型制備 健康SD大鼠64只隨機分為健康對照組（N組）、肺纖維化模型組（B組）及地塞米松治療組（D組）。（1）B組制備：將大鼠麻醉，常規消毒后無菌操作下作頸中切口，逐層分離暴露氣管，并用彎尖眼科鉗經氣管下方穿過，在直視下用針頭穿刺兩軟骨環間，抬高鼠板頭端，保持針頭與氣道方向相同，一次性將博萊霉素（BLM－A5）5mg／kg注入氣管，立即拔出針頭，豎立鼠板，保持大鼠直立體位，左右來回旋轉1～2min，使藥液盡可能到達兩側肺部。手術后縫合皮膚，置其于動物室喂養。（2）D組模型制備：在肺纖維化模型基礎上第8天開始每日腹腔注射地塞米松注射液3mg／kg。（3）N組：按照大鼠肺纖維化模型制備方法氣管內注射0.9%生理鹽水注射液0.2～0.3mL。

1.2.2 動物的處死和標本采集 分別于實驗的第7、14、28天將N組、B組各處死8只，D組于第14、28天各處死8只，方法是將大鼠眶后動脈放血處死，留取支氣管灌洗液，檢測IL－17含量；取右上肺置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，觀察肺組織結構的動態變化；留取右下肺組織，用于檢測IL－17和IL－17mRNA的含量；從肺組織上留取約50 mg肺組織，測肺組織勻漿中羥脯氨酸（HYP）含量。

1.2.3 在肺組織及支氣管灌洗液IL－17水平檢測 采用ELISA，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 采用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸水平 嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 反轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）檢測IL－17mRNA表達 采用Rat beta試劑提取總RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），以此為模板行PCR擴增目的基因引物序列，IL－17上游引物：5′－GGG AAG TTG GAC CAC CAC AT－3′；下游引物：5′－TTC TCC ACC CGG AAA GTG AA－3′，104bp；Rat beta上游引物：5′－AAG AGA GGC ATC CTG ACC CT－3′；下游引物：5′－GAG CCA GGG CAG TAA TCT CC－3′，784bp。比較IL－17與Rat beta的相對吸光度值并進行半定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料以表示。采用組內單因素方差分析和組間多重比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠肺組織病理學改變 N組雙肺呈粉紅色，表面光滑，未見腫脹和出血點。B組第7天雙肺顏色灰暗，光澤差，可見散在的灶狀、片狀出血灶。第14天兩肺呈灰白色，較堅實，肺組織腫脹部分消退，表面有大小不均勻的灰白色小斑塊，觸及較硬，彈性差；第28天兩肺呈蒼白色，質地較第14天時硬度增加，體積有所縮小，腫脹已基本消退，彈性差，表面攣縮變形，出現結節樣，條索狀病灶。

光鏡觀察N組肺組織結構正常。B組大鼠第7天肺泡炎明顯，肺泡腔內可見大量炎性細胞滲出，成纖維細胞增殖。第14天，大鼠肺炎性細胞浸潤減輕，成纖維細胞增多和膠原纖維增生，部分肺泡結構消失；第28天，大鼠肺炎性細胞浸潤進一步減輕，肺纖維化程度加重，肺泡結構破壞，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，斑片狀分布。D組病理變化與B組基本相同，不同時間點，D組炎癥細胞的浸潤和纖維細胞增生及膠原纖維的沉積要輕于B組。見圖1。

圖1 光鏡下的肺組織結構（HE×200）

2.2 HYP在各組大鼠肺組織中含量的變化 HYP含量在N組大鼠肺組織中隨時間變化無明顯改變。HYP含量在B組和D組大鼠肺組織隨時間延長逐漸增加。B組HYP含量較N組明顯增加（P＜0.05），D組HYP含量較N組明顯增加（P＜0.05），較B組明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

2.3 肺組織中IL－17mRNA和IL－17的含量 肺組織IL－17 mRNA的表達在N組小鼠肺組織中表達較弱，而在B組小鼠肺組織第7天達到高峰，第14天略有下降，第28天明顯下降，D組較N組增加（P＜0.05），較B組減少（P＜0.05）。各時間點之間有差異有統計學意義（P＜0.05，表1、圖3）。

2.4 肺組織中IL－17的含量 B組大鼠肺組織中IL－17的含量各時間點較N組相比顯著增高，且在第7天達到高峰（P＜0.05），之后IL－17含量逐漸減少，但第28天仍高于N組（P＜0.05）。D組各時間點IL－17含量均低于B組（P＜0.05），但高于N組中的含量（P＜0.05），見圖4。

圖2 HYP在各組大鼠肺組織中水平變化

圖3 肺組織中IL－17mRNA和IL－17的水平

表1 肺組織中IL－17mRNA的表達（）

表1 肺組織中IL－17mRNA的表達（）

注：－表示無數據；與N組相比，＊P＜0.05；與B組相比，＃P＜0.05。

組別 n 第7天 第14天 第28天8 0.777±0.127 0.783±0.131 0.898±0.134 B組 8 2.481±0.358＊ 2.163±0.415＊ 1.633±0.263＊D組 8 － 1.738±0.273＊＃ 1.308±0.209＊＃N組

圖4 IL－17在肺組織中的表達

2.5 支氣管灌洗液中IL－17的水平 B組大鼠支氣管灌洗液中IL－17的水平各時間點較N組相比顯著增高，且在第7天達到高峰（P＜0.05），之后IL－17水平逐漸減少，但第28天仍高于N組（P＜0.05）。D組各時間點IL－17水平均低于B組（P＜0.05），但高于 N組中的水平（P＜0.05），見圖5。

2.6 IL－17在肺組織與支氣管灌洗液中的關系及與羥脯氨酸的關系 IL－17在肺組織中與支氣管灌洗液中呈正相關（r＝0.774，P＜0.01），與羥脯氨酸呈負相關（r＝－0.831，P＜0.05）。

圖5 IL－17在支氣管沖洗液中的表達

3 討 論

IL－17是一種促炎癥性細胞因子，含有155個氨基酸的糖蛋白［2］。Th17是能分泌IL－17細胞因子的CD4＋T細胞，在人體，除了Th17細胞能分泌IL－17外，還有γδT細胞及NK細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及單核細胞，但主要的來源還是Th17細胞［3－5］。IL－17可以促進 T 細胞的激活和刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生多種細胞因子，如IL－6、IL－8、粒細胞－巨噬細胞刺激因子（GM－CSF）和化學增活素及細胞黏附分子，從而導致炎癥的產生。

應用博來霉素制備肺纖維化動物模型是目前公認最接近人肺纖維化的實驗模型［6］。肺內膠原合成的主要細胞是肺成纖維細胞，羥脯氨酸含量可以用來反映肺內膠原含量，因此纖維化程度可以用測定肺組織中羥脯氨酸含量來判斷。本研究采用氣管內注入博來霉素制備大鼠肺纖維化模型，肺纖維化模型組及地塞米松組大鼠肺組織羥脯氨酸含量的測定結果隨時間逐漸升高，提示肺纖維化動物模型制備成功。本研究發現，IL－17在博來霉素組大鼠肺纖維化發生的早期表達升高，并于造模后第7天肺泡炎癥最重時達到峰值，進而隨著肺纖維化的發展逐漸降低，但仍高于健康對照組。IL－17在肺組織表達規律和支氣管灌洗液中的變化趨相一致，呈現了先高后低的趨勢，與羥脯氨酸呈負相關。Prudhomne［7］在研究肺的囊性纖維化中，提出 Th17、IL－17與肺纖維化有關，Decraene等［8］在檢測IL－17與IL－23在肺纖維化患者痰液的mRNA表達和蛋白水平，發現了在肺纖維化的炎癥及病理發展過程中IL－23和IL－17起著重要作用。

綜上所述，提示IL－17參與了肺纖維化的全過程，為肺纖維化的診斷及治療提供了一條新的思路。但是，肺纖維化發病機制復雜，有關IL－17與肺纖維化的發病機制還需進一步研究。

［1］Melissa M，Ahmedin J，Robert A，et al.Worldwide variations in colorectal cancer［J］.CA Cancer J Clin，2009，（59）：366－378.

［2］戴小波，孫萬邦.IL－17免疫調節作用的研究進展［J］.檢驗醫學與臨床，2011，8（6）：732－734.

［3］Ferretti S，Bonnean O，Dubois GR，et al.IL－17，produced by lymPhocytes and neutrophils，is necessary for lipopolysaccharide－induced airway neutrophilia：IL－15as a possible trigger［J］.J Immunol，2003，170（4）：2106－2112.

［4］Lockhart E，Green AM，Flynn JL.IL－17production is dominated by gamma delta T cells rather than CD4Tcells during Mycobacterium tuberculosis infection［J］.J Immunol，2006，177（7）：4662－4669.

［5］Zhou Q，Desta T，Fenton M，et al.Cytokine Profiling of macrophages exposed to Porphyromonas gingivalis，its lipopolysaccharide，or its FimA protein［J］.Infect Immun，2005，73（2）：935－943.

［6］Moriya Y，Sugihara K，Akasu T，et al.Importance of extended lymphadenectomy with lateral node dissection for advanced lower rectal cancer［J］.World J Surg，2004，21（9）：728－732.

［7］Prudhomne GJ.Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer，fibrosis and immunologic disease，and therapeutic considerations［J］.Lab Invest，2007，87（11）：1077－1091.

［8］Decraene A，Willems－widyastuti A，Kasran A，et al.Elevated expression of both mRNA and protein levels of IL－17Ain sputum of stable cystic fibrosis patients［J］.Respir Res，2010，11（1）：177－184.