艾灸關(guān)元和足三里穴對癲癇大鼠細(xì)胞因子TNF－α的影響

張艷曉，張余山，黃靜波，程為平△

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040;

2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040)

癲癇(Epilepsy)是一組以腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所引起的以反復(fù)發(fā)作性突然和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常為特征的慢性腦部疾病。其發(fā)病機制極其復(fù)雜，神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)的任一環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)失衡均可影響癲癇的發(fā)病［1］。癲癇模型及癲癇患者在給予癲癇藥治療前后存在免疫異常現(xiàn)象，TNF－α作為一種重要的免疫介質(zhì)在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中也有重要作用［2，3］，艾灸關(guān)元、足三里治療癲癇在臨床上取得一定療效，本實驗通過觀察該法對癲癇大鼠血清中TNF－α含量的影響，探討該法治療癲癇的相關(guān)機制。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

雄性SD大鼠27只，清潔級，體重(220±15)g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

1．2 主要試劑與材料

戊四氮(由sigma公司生產(chǎn))，艾灸條(南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠生產(chǎn)，自制成香煙型艾條，直徑8 mm，長200 mm)，多聚甲醛(北京益利精細(xì)化學(xué)品公司生產(chǎn))，IL－6酶聯(lián)免疫試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)，丙戊酸鈉(江蘇恒瑞醫(yī)藥)。

1．3 動物分組

未造模前從27只大鼠中用查隨機數(shù)字表法隨機選取3只作為空白對照組，同法將造模成功的其余24只大鼠隨機分為3組，每組8只，分別為模型組、艾灸組、藥物組。

1．4 造模方法

給大鼠腹腔注射戊四氮(PTZ)癲癇發(fā)作閾下劑量35．0 mg/kg，每天09:00～10:00注射，注射20～29天達(dá)點燃標(biāo)準(zhǔn)，注射后觀察30～50 min，根據(jù)大鼠癲癇發(fā)作的行為表現(xiàn)，參照Racine［4］的評分標(biāo)準(zhǔn)分為6級:0級:無任何反應(yīng);Ⅰ級:面部抽搐及咀嚼;Ⅱ級:點頭和(或)甩頭;Ⅲ級:前肢陣攣，但無直立位;Ⅳ級:前肢陣攣伴伸直;Ⅴ級:前肢及全身陣攣，失去平衡，跌倒。Ⅲ級及以下為輕型發(fā)作，Ⅳ級及以上為重型發(fā)作。點燃標(biāo)準(zhǔn):大鼠連續(xù)5次PTZ腹腔注射，均表現(xiàn)為Ⅳ級或V級的發(fā)作。造模期間空白組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水。

1．5 治療方法

各組大鼠均于發(fā)作間歇期清醒固定于鼠板上，以安靜為度，艾灸組給予艾灸治療:①選穴及定位:足三里、關(guān)元取穴定位參照“十五”國家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實驗針灸學(xué)》和《腧穴學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位及擬人對照法定位，足三里穴定位:膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處;關(guān)元穴定位:臍下約25 mm處。②艾灸方法:每次取關(guān)元和雙側(cè)足三里穴，剃毛后，持自制艾條于穴位上2～3 cm處懸灸，采用溫和灸補法，以大鼠皮膚微紅且不出現(xiàn)疼痛為度，每穴每次灸15 min［5］，每日1次，每日09:00～10:00進(jìn)行。艾灸結(jié)束后藥物組按藥物說明以15．75 mg/kg丙戊酸鈉灌胃，每日1次，空白組和模型組不予任何處置，共治療20天。治療結(jié)束前，參照Racine的6級評分標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)。

1．6 標(biāo)本采集與指標(biāo)測定

治療結(jié)束后分別將空白組、模型組、藥物組及艾灸組的大鼠開胸暴露心臟，從心臟中抽取5 ml血液，3000 r/min離心5 min，取上清液，－20℃保存。測定前置室溫復(fù)融，用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說明書方法測定血清中TNF－a的變化。

1．7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，應(yīng)用SPSS17．0軟件處理，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

酶聯(lián)免疫法測定標(biāo)本后，各組大鼠體內(nèi)所測TNF－α值如表1所示:空白組與模型組相比 P＜0.05，兩者之間存在顯著差異，模型組TNF－α含量明顯高于空白組。與模型組比較，藥物組與艾灸組均P＜0．05，治療有意義，兩治療組含量均下降。藥物組與艾灸組之間比較P＞0．05，兩組之間無差別，療效基本相同。

表1 各組大鼠血清TNF－α值

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作等級統(tǒng)計結(jié)果

造模后至治療結(jié)束前，對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察，造模后各組大鼠發(fā)作等級均在Ⅳ～Ⅴ級，表現(xiàn)為前肢及全身陣攣，失去平衡，跌倒等。隨著治療的進(jìn)行，模型組仍為Ⅳ級以上發(fā)作;艾灸組及藥物組發(fā)作等級則為Ⅳ級以下，且發(fā)作次數(shù)明顯減少。各組癲癇發(fā)作等級統(tǒng)計及分析結(jié)果如圖1和表2所示:藥物組與模型組相比較P＜0．01，艾灸組與模型組相比P＜0．01，兩組治療均有統(tǒng)計學(xué)意義，發(fā)作等級明顯下降;艾灸組與藥物組相比P＞0．05，無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間治療效果無明顯差別。

圖1 造模后至治療結(jié)束各組癲癇發(fā)作等級

3 討論

癲癇的發(fā)病機制十分復(fù)雜，臨床觀察和實驗研究發(fā)現(xiàn)，TNF－ α 在癲癇過程中發(fā)揮重要作用［6，7］。TNF－α可以通過增加突觸傳遞的效率［8］，控制突觸的可塑性、促進(jìn)腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞增殖［9］、影響興奮性氨基酸和抑制性氨基酸比例［10］，促進(jìn)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6的釋放等多種機制影響癲癇的發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癲癇的形成是由臟腑失調(diào)，痰濁瘀阻，氣機逆亂，風(fēng)陽內(nèi)動，風(fēng)陽痰濁蒙蔽清竅，流竄經(jīng)絡(luò)所致。病理性質(zhì)屬本虛標(biāo)實，宜固本培元、扶正調(diào)絡(luò)。艾灸能溫補陽氣，調(diào)整諸陽，達(dá)到補益機體一身之陽、激發(fā)人體正氣的目的;關(guān)元穴為任脈與足三陰的交會穴，三焦元氣所發(fā)處，聯(lián)系命門真陽，為陰中之陽穴，功善溫陽益氣、固本培元;足三里穴亦為強壯要穴，功善扶正培元、調(diào)和氣血、調(diào)經(jīng)活絡(luò)。艾灸兩穴，培元扶正，使正盛邪去，臟腑氣血調(diào)和，精氣四布以濡養(yǎng)經(jīng)脈，上輸清竅以充養(yǎng)元神，腦神得以濡養(yǎng)，則癲癇治之。

本實驗通過腹腔注射戊四氮制造癲癇大鼠模型成功后，大鼠有分級明確的癲癇發(fā)作，經(jīng)治療后，發(fā)作等級及發(fā)作次數(shù)均明顯下降，說明艾灸關(guān)元、足三里對癲癇大鼠有一定的療效。細(xì)胞因子方面，模型組大鼠血清中TNF－α含量遠(yuǎn)高于空白組，而經(jīng)治療后艾灸組血清中TNF－α含量明顯低于模型組，說明TNF－α在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中有重要的作用，并且艾灸關(guān)元、足三里治療癲癇的機制與調(diào)節(jié)體內(nèi)TNF－α含量有密切的關(guān)系。但TNF－α作用機制復(fù)雜，具體的作用途徑還有待進(jìn)一步的研究。另外除了細(xì)胞因子方面，艾灸關(guān)元、足三里在神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等其他方面的影響也可作為下一個研究方向。

［1］ 朱長庚．神經(jīng)－免疫－內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)與癲癇發(fā)病機理的關(guān)系［J］．解剖學(xué)報，2002，33(3):321 －324

［2］ Viviani B，Bartesaghi S，Gardoni F，et al．Interleukin －1beta enhances NMDA recep to r－mediated intracellular calcium increase through activation of the Src family of kinases［J］．Neurosci，2003，23(25):8692－8700

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［4］ Racine RJ．Modification of seizure activity by electrical stimulation II Motor seizure［J］．Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(3):281－294

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［10］ De LaurentiisA，Pisera D，Lasaga M，et al．Effect of interleukin －6 and tumor necrosis factor－alpha on GABA release from mediobasal hypothalamus and posterior pituitary［J］．Neuroimmunomdulation，2000，7(2):77 －83