大蒜莖尖離體再生體系的建立

宋淑敏，劉偉偉，王云云，高 宇，潘 靜，王曉楠

(黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163319)

大蒜(Allium sativum L.)在我國已有2 000多年的栽培歷史。目前我國大蒜種植面積達26.6萬hm2，占亞洲的1/2，占世界的1/3;同時中國是世界上大蒜的主要出口貿易國之一，產品遠銷東南亞、日本、中東、美國、俄羅斯等國家及地區，為我國換取了大量的外匯。大蒜具有很高的營養價值，是很好的滋補強身蔬菜。大蒜對多種致病微生物及寄生蟲有較強的抑制或殺滅作用，被醫務工作者稱為植物性廣譜抗生素，它對心臟病、高血壓和某些癌癥也有預防作用。隨著經濟的發展，人們越來越重視大蒜的營養以及保健價值，大蒜的需求量逐年增加，大蒜及其加工產品已廣泛應用于調味品、食品、醫藥、飼料及美容等行業。

黑龍江省是我國大蒜的主產區，其中阿城大蒜、寧安大蒜以其獨特的風味和極佳的品質享譽全國，深受廣大消費者的喜愛，并遠銷到日本、韓國等地。1998年阿城被國家命名為“中國北方大蒜之鄉”，2008年“阿城大蒜”注冊為農產品國家“地理標志”商標。但由于多年的連作致使品質退化，具有800年種植歷史的阿城大蒜種植業正走向衰退、崩潰的邊緣。阿城紫皮大蒜退化的根本原因為是由于農民常年自留蒜種，在使用過程中嚴重感染病毒病，致使品種嚴重退化，產量和品質降低。據測定，大蒜病毒病發病率達到90%以上，大蒜感染病毒病主要表現為蒜頭逐年變小、產量低、品質差，一般減產達到30% ～50%;不僅直接造成農業損失，也使我省的名、優、特品種失去了市場競爭優勢，甚至使一些珍稀品種瀕臨滅絕，嚴重制約了我省大蒜產業發展。應用組織培養技術培育、繁育脫毒蒜用于生產是防治病毒病的有效途徑。國內外關于大蒜脫毒苗的培育已有大量的研究，應用莖尖分生組織培養獲得脫毒苗是當前普遍采用的方法，許多品種都已獲得了脫毒苗。但應用莖尖組培脫毒，因取材較小，莖尖成活率和分化率不高，繁殖系數低，嚴重地制約了大蒜脫毒種苗的繁育及應用進程。目前黑龍江省大蒜生產上急需優質脫毒種蒜，但我省還沒有專門從事大蒜脫毒及原種繁育為一體的科研單位。

本研究的目的是以黑龍江省名優大蒜莖尖為材料，采用不同濃度激素、蔗糖進行配比，篩選高效的分化、繼代、生根培養基;對莖尖離體培養技術和培養條件進行系統研究，以期探索一套適于黑龍江省名優大蒜莖尖脫毒技術體系，為大蒜脫毒種苗的工廠化生產提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用新收獲的阿城大蒜，將鱗莖放入4℃～6℃的冰箱中貯藏30～40 d，以打破休眠備用。

1.2 材料預處理及外殖體表面消毒

挑選無病斑的鱗莖，將鱗芽剝去表皮，用紗布包裹好，先用自來水沖洗0.5 h，然后在超凈臺上，用75%的酒精表面消毒2 min，再用20%的次氯酸鈉表面消毒20 min，然后用無菌水洗3次。

1.3 莖尖剝離方法及培養條件

在超凈工作臺上，用解剖刀剝取經表面消毒鱗芽里面的葉芽，放在40倍解剖鏡下，再用解剖刀剝取0.2～0.5 mm的莖尖，接種到培養基上。然后放在室溫為25℃，光照強度為2 000 LX，光照時間為12 h/d的培養室中培養。

1.4 基本培養基的篩選

以阿城大蒜莖尖為材料，分別接種到附加6—BA1.0 mg/L、NAA0.1 mg/L 的 MS、B5、N6培養基中，接種15d 后統計莖尖的成活率和綠苗繁殖倍數。

1.5 不同濃度激素配比對莖尖分化率的影響

以MS為基本培養基上，附加不同濃度的6—BA、NAA、IAA的激素組合，共設了8個處理，每個處理接種莖尖90個，15 d后統計莖尖分化率和綠苗繁殖倍數。

1.6 繼代培養基篩選

當從莖尖分化出的綠苗高2 cm左右時，應及時轉入到繼代培養基中。繼代培養基以1/2MS為基本培養基，對6—BA 0 ～0.5 mg/L、NAA 0 ～1.0 mg/L、IAA 0 ～1.0 mg/L 不同濃度激素進行配比試驗，pH為5.8～6.0，共設13個處理，15 d后觀察統計苗的長勢及生根情況。

1.7 生根培養基篩選

以1/2MS培養基成分為基礎，pH值為5.8～6.0，調整植物激素 IAA(0.1 ～0.5)mg/L、NAA(0.1 ～0.5)mg/L、蔗糖(10 000～60 000)mg/L濃度，共設G1～G15組進行試驗。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對莖尖分化率和綠苗的增殖倍數的影響

我們選用B5、MS、N6三種培養基作為莖尖分化培養基，三種培養基均附 1.0 mg/L6—BA、0.1 mg/LNAA，pH 為5.8～6.0。試驗結果如表1所示。

表1 B5、MS、N6培養基對大蒜莖尖分化的影響Tab.1 The effect of B5、MS、N6medium on the differentiation of garlic shoot-tip of

從表1的試驗結果我們可以看出，不同培養基對莖尖分化率影響差異顯著，以MS培養基培養效果最好，莖尖的分化率、綠苗的增殖倍數最高;B5培養基培養效果要好于N6培養基。試驗結果表明，大蒜莖尖分化培養基的優劣順序為MS＞B5＞N6。

2.2 不同激素配比對莖尖分化率及綠苗繁殖倍數的影響

我們以MS培養基為莖尖分化的基礎培養基，并附加了不同濃度的 6—BA、NAA、IAA，pH 為 5.8 ～ 6.0，共設了8個處理。莖尖接種到分化培養基中，20 d后統計莖尖分化率及綠苗增殖倍數。試驗結果如表2所示。

表2 不同濃度激素配比對莖尖分化率及綠苗增殖倍數的影響Tab.2 Effects of different concentrations of hormones on rate of shoot-tip differentiation and multiplication of green plantlet

從表2可以看出，8個處理均有綠芽的分化，但以1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA 激素組合效果為最好，莖尖的分化率達93.3%，繁殖倍數為5.2;當6—BA濃度超過1.5 mg/L，隨著6—BA濃度的增加，莖尖的分化率降低，分化出玻璃苗的數量增加。因此，最佳的莖尖分化培養基為F3:MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA。

2.3 不同繼代培養基對苗的長勢影響

表3的試驗結果表明:在13種繼代培養基中，D3、D7、D8培養基繼代效果較好，其中以D7培養基的繼代效果最好，在D7培養基中幼苗生長健壯，苗的成活率最高，達100%。其次是D3，該培養基中苗的成活率較高，并有一定數量的幼苗生根，但苗的成活率低于D7。因此，最適的繼代培養為:1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。從表 3中我們還可以看出當繼代培養基附加6—BA 0.1 mg/L時，NAA濃度0.2～1.0 mg/L，隨著NAA增加綠苗的成活率和生根率也隨之增加。

表3 不同繼代培養基對綠苗長勢的影響Tab.3 Effects of different subculture medium on growth of green plantlet

2.4 生根及移栽

選取3～5 cm高的試管苗，在超凈臺上將苗基部的愈傷組織去除，分別轉入到15種生根培養基中，pH為5.8～6.0，在25℃ ～28℃，光照強度為2 000 LX，光照時間為12 h/d條件下培養，20 d后統計生根率、根長、試管鱗莖的誘導率。當根長達2～3 cm時，打開瓶膜，加入一定量的蒸餾水，讓試管苗充分吸收水分，煉苗1～3 d，然后將根部的培養基洗凈，進行移栽，移栽后要澆透水，注意避光、保濕，15 d后統計移栽成活率。試驗結果如表4所示。

試驗結果表明:不同濃度生長素、蔗糖對根的誘導率和生根數有較大影響，其中以 1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖組合的效果最佳。在該組合培養基中，大蒜試管苗植株健壯，不定根發生數量較多，并對試管鱗莖的形成有一定的促進作用，有利于試管苗移栽成活。試管苗的生根率達95%，移栽成活率為98.6%，試管微鱗莖的誘導率為15%，均高于其他組。因此，最佳的生根培養基為:1/2MS 附加 0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L蔗糖。

3 小結

A.本研究初步建立了適于黑龍江省大蒜莖尖離體再生技術體系。獲得試管苗7 000余株。為培育優質、高產的黑龍江大蒜奠定了基礎，對解決黑龍江省名優品種種性退化、促進大蒜產業發展及提高農民收入具有重要意義。

B.本試驗篩選出最適莖尖分化培養基MS+1.0 mg/L6—BA+0.1 mg/LNAA，莖尖的分化率達 93.3%，繁殖倍數為 5.2;最適繼代培養基 1/2MS+0.2 mg/L6—BA+0.2 mg/LNAA。最佳的生根培養基為1/2MS附加0.1 mg/LIAA、0.5 mg/LNAA、60 000 mg/L 蔗糖。

表4 不同的激素配比對試管苗的生根率及移栽成活率的影響Tab.4 Effects of different hormone on rooting rate and transplanting survival rate of plantlets in vitro

C.大蒜莖尖離體培養受多種因素的影響，在分化培養中生長素和細胞分裂素在調控離體器官發生中起關鍵作用。

本試驗研究結果表明:較高濃度的6—BA和低濃度的NAA有利于大蒜莖尖綠苗的分化。在繼代培養中，加入較高濃度的NAA和IAA，苗易生根;低濃度的生長素配合低濃度的細胞分裂素有利于苗的復壯。此外，如何提高綠苗的增殖倍數及誘導大蒜試管微鱗莖形成還有待進一步研究。