秦皇島地區夏冬季病毒感染與兒童急性上呼吸道感染臨床分析

顧艷紅 劉蘭吉 劉波 陳旭霞 蘇穎

急性上呼吸道感染是兒科最常見的疾病之一，引起急性呼吸道感染的病毒群至少有7個病毒科10多類共239個型別的病毒［1］。兒童上呼吸道感染的病毒病原學研究尚缺大樣本的系統研究。2009年，甲型H1N1流行性感冒在全世界爆發［2］。2010年8月，世界衛生組織(WHO)宣布2009甲型H1N1流感進入大流行后階段［3］。秦皇島地區位于燕山山脈東段丘陵地區與山前平原地帶，氣候類型屬于暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候。但受海洋影響較大，四季分明。我院為三級甲等醫院，患者來自覆蓋秦皇島地區的三區、四縣。為調查在該特定背景下我市兒童急性上呼吸道感染夏冬季節的病毒感染特征，我院采用多重PCR方法進行系統的相關研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 依據上呼吸道感染診斷標準［4］，選取來秦皇島市第一醫院門診就診的0～14歲急性上呼吸道感染患兒：2010年6月至2010年8月共191例，因標本破碎、病史記錄不清等剔除22例，送檢標本169份。其中男91例，女78例;年齡0～1歲26例，1～歲48例，3～歲48例，6～14歲47例。2010年11月至2011年1月共182例，因標本破損、病史記錄不全剔除30例，送檢標本152份。其中男85例，女67例;年齡：0～歲19例，1～歲49例，3～歲43例，6～14歲41人。入選病例病程均在72 h內。

1.2 分組 按性別分男組，女組。按年齡分0～歲組、1～歲組、3～歲組、6～14歲組。按季節分夏季組、冬季組。按病程分：病程0～ h組，24～ h組，48～72 h組。以外周血超敏C-反應蛋白(CRP)≤5 mg/L為正常值，＞5 mg/L為升高，分成2組。按有無基礎疾病分：既往健康組，存在先天性心臟病、營養性貧血、免疫功能低下、反復呼吸道感染等基礎疾病組。

1.3 實驗方法及步驟 本實驗共采用3組PCR引物用于檢測15種呼吸道病毒。第1組引物用于擴增腺病毒A/B/C/D、冠狀病毒229E/NL63、1、2、3型副流感病毒;第二組引物用于擴增冠狀病毒OC43/HKU1、鼻病毒A/B/C、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B;第3組引物用于擴增博卡病毒1/2/3/4、乙型流感病毒、偏肺病毒、副流感病毒4型、腸道病毒。

1.3.1 標本采集：入選患兒均在就診時進行標本采集：選用專業的絨毛拭子從患兒咽后壁涂抹咽部分泌物標本，立即至于保存液中，置于-70℃低溫冰箱保存直至檢測，記錄患兒病史、癥狀及體征。

1.3.2 實驗方法

1.3.2.1 病毒核酸提?。翰捎庙n國的iNtRON Biotechnology公司生產的Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA Extraction Kit，按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取標本中的病毒核酸。

1.3.2.2 反轉錄合成CDNA：按美國Fermantas公司試劑盒說明書操作，8 μl Total RNA，1 μl randam hexamer(0.2 μg/μl)，3 μl DEPC-treated water，70℃，5 min，冰浴，加 2 μl 10 mmol/L dNTP，1 μl RNase inhibitor(20 U/μl)，混勻離心，37℃5 min，加入1 μl Reverse Transcriptase(200 U/μl)致終體積 20 μl，42℃60 min，70℃10 min，冰浴待用，-20℃保存。

1.3.2.3 多重PCR擴增：使用Seegene公司生產的15種呼吸道病毒檢測試劑盒(杭州紐羅西敏生物科技有限公司代理)。PCR擴增條件：94℃預變性 15 min，94℃變性 30 s，60℃退火1.5 min，72℃延伸 1.5 min，40 個循環后，72℃ 延伸 10 min，多重PCR產物置4℃保存至電泳檢測。

1.3.2.4 電泳檢測擴增產物：采用水平式瓊脂糖凝膠電泳儀，用全自動凝膠成像分析系統進行照相及分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各呼吸道病毒的DNA檢測結果 成功擴增出各呼吸道病毒的 DNA、CDNA結構，分別為冠狀病毒229E/NL63，腺病毒，甲型流感病毒，鼻病毒，冠狀病毒OC 43/HKU 1，間質肺病毒，腸道病毒，異型流感病毒;博卡病毒，通過1.0%的瓊脂糖凝膠，60 V低電壓電泳觀察結果(圖1～6)。具體病毒檢出情況。見表1。

2.2 總體病毒檢出率 共檢測標本321份，陽性208份，總檢出率64.80%。

2.3 病毒檢出率與性別的關系 男女之間病毒檢出率間差異無統計學意義(χ2=0.06，P ＞0.05)。見表2。

圖1 M：RV15-A Marker;6、9 和10號大小為189 bp，為副流感病毒3 229E/NL63;7號大小為534 bp，為腺病毒;1～5和8號分別為陰性結果

圖2 M：RV15-A Marker，1～9為陰性結果，大小為375 bp，為冠狀病毒;11號大小為264 bp，為副流感病毒2

圖3 M：RV15-BMarker;1～3，5號為陰性結果;4號大小為206 bp，為甲型流感病毒

圖4 M：RV15-BMarker;1～10為陰性結果;11號大小為394 bp為鼻病毒;12號大小為578 bp，為冠狀病毒OC 43/HKU 1

圖5 M：RV15-CMarker;1～7，9～11，為陰性結果;8號大小為351 bp，為間質肺病毒;12號大小為455 bp，為異型流感病毒;13號大小579 bp，為博卡病毒

圖6 M：RV15-CMarker;1，2，4號為陰性結果;3號大小為194 bp，為腸道病毒

表1 病毒檢出情況 例

2.4 病毒檢出率與年齡的關系 夏季：1～歲組、3～歲組病毒檢出率明顯高于0～歲組及6～14歲組(P＜0.05)。冬季：0～歲組、1～歲組病毒檢出率明顯高于3～歲組，6～14歲組

表2 病毒檢出率與性別的關系 例

表3 病毒檢出率與年齡的關系(夏季)

表4 病毒檢出率與年齡的關系(冬季)

2.5 病毒檢出率與季節的關系 冬季病毒檢出率明顯高于夏季(χ2=13.175，P ＜0.01)。見表5。

表5 病毒檢出率與季節的關系

2.6 病毒檢出率與病程的關系 發病病程在24 h內的檢出率高(P＜0.05)，24～48 h病毒檢出率及48～72 h檢出率差異無統計學意義(P＞0.05)。見表6。

表6 病毒檢出率與病程的關系

2.7 病毒檢出率與超敏CRP的關系 超敏CRP正常組的病毒檢出率明顯高于超敏CRP升高組病毒檢出率(χ2=31.355，P ＜0.01)。見表7。

表7 病毒檢出率與超敏CRP的關系

2.8 病毒檢出率與患兒基本健康狀況的關系 單純上呼吸道感染組的病毒檢出率與存在基礎疾病組的病毒檢出率差異無統計學意義(χ2=0.142，P ＞0.05)。見表8。

表8 病毒檢出率與患兒基本健康狀況的關系

3 討論

急性上呼吸道感染是人類最常見的疾病之一，兒童發病率極高。有研究表明，我國城市兒童每年平均患病3～6次，農村兒童每年平均患病2～5次［4］。急性上呼吸道感染病原體以病毒為主。

3.1 檢測方法 本研究檢測急性上呼吸道感染的患兒咽部分泌物病毒檢出率為64.80%，與石偉先等［5］所做的病毒檢出率63.08%相近，低于 Chung等［6］及孔梅等［7］所做的兒童下呼吸道感染的病毒檢測率大于70%。但高于羅翌等［2］報道的包括成人在內的上呼吸道感染的病毒檢出率49.2%?？紤]與感染的部位、采集的標本不同有關：下呼吸道感染所采集的是深部的痰，而上呼吸道感染采集的是咽部分泌物，病毒含量相對較低，所以上呼吸道感染病毒檢出率低于下呼吸道感染;而羅翌等［2］所做的病毒檢測手段為病毒分離法，該方法特意性較強，但其消耗時間長，需要成本高，分離陽性率低，況且對某些病毒如人鼻病毒、人冠狀病毒、副流感病毒等進行細胞分離培養較困難［8］。而我們所采取的是多重PCR方法。此種方法最大的優點是敏感、特異、快速，使某些不能培養或難以培養的病毒能得以檢測，可同時檢測多種病毒病原體。尤其是與相關技術合并后，其功能更為強大。其準確性、靈敏度和特異性大為增強。本研究中所采用的方法就是在多重PCR技術的基礎上使用了DPOTM(DSOTM)技術應用于引物設計，消除了既往多重PCR容易出現的非特異性條帶問題，同時引物的高效性與PCR產物的大小所帶來的矛盾，也得到很好的解決，同時提高了反應的特異性。DPOTM(DSOTM)技術還消除了多重PCR引物之間的互相干擾，大大提高了多重PCR的敏感性。在短時間內對15種病毒進行檢測，大大提高了病毒檢出的準確性，節省了時間。當然，不同研究病毒檢出率的不同，也可能與不同病毒的流行特征及地區分布不同有關。

3.2 性別因素 本研究結果顯示，上呼吸道感染患兒病毒檢出率男女之間無差異性(P ＞0.05)，與相關報道［9］一致，提示呼吸道病毒感染無性別差異。

3.3 病毒檢出率與季節有關 冬季檢出率明顯高于夏季(P＜0.05)，支持病毒感染多見于冬春季［9］?？紤]其原因可能有以下幾點：(1)冬季天氣寒冷，導致血液循環速度下降，從而導致人體免疫功能降低，白細胞吞噬功能減弱。(2)寒冷刺激導致副交感神經興奮，氣道反應性增高，從而支氣管易發生痙攣，有利于病原體的繁殖。(3)冬春季節空氣寒冷干燥使皮膚，尤其是口鼻黏膜變得更脆弱，氣道的纖毛運動減弱，黏液分泌減少，黏液黏稠度增加，導致呼吸道塵埃積聚及病原清除率下降［10］。

3.4 患病時間因素 本次研究發現，病程0～24 h的患兒病毒檢出率最高，考慮可能與病程早期病毒數量大、病毒毒性強、尚未用藥等因素有關。隨著病程的延長，病毒檢出率下降，支持大部分病毒感染為自限性疾病。也可能與應用藥物有關。

3.5 CRP水平因素 CRP是由肝臟合成，當機體受到組織損傷或炎性反應時迅速增加，故稱急性時相反應蛋白［11］。研究已正實，CRP在健康人血清中以微量形式存在，而在炎癥和組織損傷時，由巨噬細胞釋放白介素，并迅速刺激肝臟合成。其不但能敏感的反應機體的炎性反應，并有激活補體及促進粒細胞和巨噬細胞的吞噬作用，具有與補體相似的調整和凝集作用，從而促進巨噬細胞吞噬，刺激單核細胞表面的組織因子，表達及免疫調節功能。當細菌感染時，CRP血中濃度會急劇升高［12］。既往對于超敏CRP的研究較少。本研究發現，外周血超敏CRP正常組病毒檢出率明顯高于超敏CRP升高組的患兒(P＜0.05)，提示超敏CRP在診斷病毒感染中有重要的參考價值，且此項檢查方便，短時間就能出結果，為臨床疾病的早期診斷及合理應用抗生素提供了理論依據。

3.6 基礎疾病因素 在本次研究中，既往身體健康，單純上呼吸道感染組的病毒檢出率與存在基礎疾病組的病毒檢出率差異無統計學意義(P＞0.05)。存在基礎疾病，提示患兒免疫功能欠佳，使其容易感染各種疾病。但本次研究結果卻顯示兩者病毒檢出率無明顯差異。分析原因為本次入選的患兒均是存在上呼吸道感染癥狀的患兒，且研究時間較短，故檢出率無明顯差別。如要系統研究二者的區別，應擴大樣本遠期隨訪，通過固定入選人員，結合在一定時間內感染的次數、感染后的癥狀、感染后持續的時間、治療手段及輔助檢查結果等多方面系統研究。

本次研究，因時間、資金等原因，研究的季節僅限于夏季與冬季，且只有1年。其研究結果可能存在一定的偏差。但在一定程度上，反應了短時期內的呼吸道病毒感染情況，為兒童急性呼吸道感染的診治提供了依據。

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