硝酸鹽還原試驗直接檢測痰標本中結核分枝桿菌耐藥性

張衛 劉華 趙文艷 馬延 田艷生

WHO報道，在2005年，全球有880萬結核病新發病例，死亡病例160萬［1］，而且，這種情況隨著艾滋病及耐多藥結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的流行而日趨嚴峻［1-3］。監測MTB耐藥性是控制耐多藥菌株流行的有效方法之一，然而，目前所用方法，受到檢測費用高和檢測時間長等不利因素的限制，因此，急需發展快速價廉的檢測方法。近年來，國外學者報道用硝酸鹽還原試驗(nitrate reductase assay，NRA)在固體或液體培養基的基礎上，直接或間接檢測痰標本中MTB的耐藥性，大大的縮短了結果報告時間［4-6］。然而，國外對此方面的報道僅限于1～2種藥物［4-6］，且國內此方面的報道較少，因此，我們應用NRA法在液體培養基的基礎上直接檢測痰標本中的MTB對4種一線抗結核藥物利福平(RMP)、異煙肼(INH)、鏈霉素(S)及乙胺丁醇(EMB)的耐藥性，同比例法結果進行比較，評價該方法的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 156份涂陽痰標本(≥+)來自華北石油總醫院結核科2009年1月至20011年5月門診及住院患者。

1.2 試劑與儀器 Middlebrook 7H9培養基、OADC(oleic acidalbumin-dextrose-catalase)添加劑、PANTA(polymyxin B，amphotericin B，nalidixic acid，trimethoprim，azlocillin)添加劑均購自美國BD公司;利福平、乙胺丁醇、異煙肼及鏈霉素藥物粉劑(美國Sigma公司);改良羅氏培養基為本室自制;H37RV標準敏感菌株(中國藥品生物制品檢定所)。

1.3 方法

1.3.1 標本處理：痰標本首先進行厚涂片抗酸染色，方法及結果判定參照文獻［7］。涂陽痰標本(≥+)5～10 ml加入50 ml無菌離心管中，加等體積0.5%NaCl-NaOH(0.1 mol/L檸檬酸三鈉50 ml與4%NaOH 50 ml混合后滅菌，用前向混合液中加入0.5 g NaCl粉劑，24 h內使用)溶液，漩渦震蕩混勻1 min，室溫消化15 min，加磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)至50 ml混勻，5 000 r/min離心20 min，棄上清，再加磷酸鹽緩沖液重懸沉淀物至2.5 ～3 ml。

1.3.2 標本接種：參照文獻［4-6］，Middlebrook 7H9液體培養基(每支4.6 ml)用前加入0.5%甘油、10%OADC、0.2%PANTA和1 000μg/ml NaNO3，取處理后混懸液0.4 ml分別加入4支含藥Middlebrook 7H9液體培養基(各含藥培養基終濃度為RMP 2.0 μg/ml、INH 0.2 μg/ml、S 1.0 μg/ml、EMB 5.0μg/ml)，另取1∶10稀釋后混懸液0.4 ml加入1支不含藥Middlebrook 7H9液體培養基為對照管，均置37°C培養。

1.3.3 NRA試驗：參照文獻［8］，取0.2 ml新鮮配置的硝酸鹽還原試劑(一份50%濃鹽酸，2份0.2%氨基苯磺胺，2份0.1%N-甲萘基乙烯二胺鹽酸鹽)加至培養5 d后的1 ml不含藥對照培養基中，無顏色變化為陰性，有顏色變化為陽性(+～++++，粉紅～深紅～紫紅)。如對照培養基陰性，繼續孵育至7、10、14、18 d(終止)重復試驗。INH、S和 EMB 結果判定：如含藥培養基顏色變化相同或大于1∶10稀釋的不含藥對照培養基，判定為耐藥，如無顏色變化或顏色變化小于1∶10稀釋的不含藥對照管，判定為敏感。RMP結果判定：如含藥培養基有顏色變化判定為耐藥，無顏色變化判定為敏感。每支陽性管取2滴混懸液接種血瓊脂培養基，37℃，孵育48 h后排除其他細菌污染。

1.3.4 比例法藥敏試驗：取上述標本處理后混懸液0.1 ml，分別接種2支改良羅氏培養基，以下步驟按中國防癆協會制定的“結核病診斷實驗室檢驗規程”［7］，藥物濃度：RMP(40 μg/ml)、INH(0.2 μg/ml)、S(4 μg/ml)、EMB(2 μg/ml)。

1.3.5 質控：用H37RV標準敏感株為質控菌株。

1.4 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，NRA性能觀察指標用敏感度和特異度表示，兩種方法的一致性分析用kappa檢驗：＜0.2為微弱;0.21～0.4為弱;0.41～0.6為適中;0.61～0.8為顯著;0.81～1.0為極佳。

2 結果

2.1 NRA法成功情況 156份痰標本中，有124份(79.5%)成功的進行了NRA檢測，32份標本無效(20.5%)。124份有效標本抗酸染色結果為：1+標本21份(16.9%)，2+標本42份(33.9%)，3+標本36份(29.0%)，4+標本25份(20.2%)。32份無效標本中有11份標本(7.1%)污染，21份標本(13.4%)在18天時陰性，抗酸染色結果為：1+標本16份(10.3%)，2+標本3份(1.9%)，3+標本1份(0.6%)。

2.2 NRA法和比例法結果獲取時間比較 NRA結果在5 d獲得3份(2.4%)，7 d獲得 23份(18.5%)，10 d獲得 51份(41.1%)，14 d獲得38份(30.6%)，18 d獲得 9份(7.3%)，62.1%的結果可在10 d獲得，結果平均獲得時間為11.1 d。比例法結果在14 d獲得5份，21 d獲得21份，28 d獲得45份，35 d獲得34份，49 d獲得19份，結果平均獲得時間為31.4 d。兩種方法的結果獲取時間差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 NRA法和比例法檢測結果比較 以比例法結果為判斷標準，NRA法檢測MTB對RMP、INH、S、EMB的耐藥性有很好的敏感度(100%、100%、90%、94.3%)和特異度(98.8%、98.9%、96.0%、96.8%)，一致性kappa檢驗分析結果表明，有極佳的一致性(0.98、0.98、0.91、0.92)。見表 1。

表1 NRA法和比例法直接檢測痰標本中MTB耐藥性結果比較

3 討論

目前檢測MTB耐藥性的標準方法有基于羅氏培養基的比例法、絕對濃度法、耐藥比率法、微放射法(BACTEC-460系統)等。然而，這些方法不是耗時太長，就是產生放射性廢物，基層醫院很難推廣，目前的商業方法，如 MTB生長指示管法(MGIT)、分子方法，雖然快速，但價格昂貴，也不適用于基層醫院。而基層醫院是控制耐多藥MTB流行和傳播的重點，因此，我們參照國外學者的研究，用NRA法直接檢測痰標本中的MTB對四種一線抗結核藥物的耐藥性，結果顯示NRA法有很好的敏感度和特異度，同比例法結果有很好的一致性，同國外報道［4-6］相符。

MTB可在液體培養基中快速生長，但用液體培養基從臨床標本(如痰)中直接檢測MTB的耐藥性時，易受到雜菌的污染，培養基中加入抗菌素，可減少或防止污染，這種方法已成功應用于BACTEC-460檢測系統和MGIT法，在本研究中，我們使用PANTA抗菌素混合液，污染率為7.1%，同國外報道［4-6］相符。我們還觀察到，污染的培養基大多為INH、S、EMB含藥管，硝酸鹽還原試驗仍為陽性，RMP含藥管污染較少，說明大多數污染菌對RMP敏感，提示應仔細檢查耐藥的標本，耐藥標本應接種血瓊脂培養基排除其它雜菌污染。

NRA法直接用于涂陽痰標本耐藥性測定，不僅可用于痰菌較多的標本，也可用于痰菌較少的標本，我們的結果顯示，可用于NRA直接檢測的痰標本50.8%為+～++。在本研究中，我們囑患者留取痰標本時，一定要清晨漱口后咳深部痰，一方面要保證標本質量，另一方面，標本量要適中(5～10 ml)，保證MTB在培養基中適量，而非過量生長。在本研究中，NRA法直接檢測痰標本中MTB耐藥性成功率為79.5%，同國外報道［4］相符。用NRA法檢測無效的標本在改良羅氏培養基上亦未生長，且主要為痰菌+標本，分析為標本中MTB含量較少，或因抗結核藥物作用而使涂片所見的MTB多數已喪失生命力［9］。

有1份標本兩種方法的INH、RMP和S結果均有差異，重復試驗結果同前，NRA法對INH、RMP、S耐藥，比例法結果卻均為敏感，此標本來自一化療失敗患者，先前曾持續檢出過耐多藥MTB菌，分析可能該患者痰標本中混合有敏感MTB和耐多藥MTB，因耐多藥MTB有時在改良羅氏培養基上較敏感MTB生長困難，而在添加了OADC的Middlebrook 7H9液體培養基上卻生長良好。此外，NRA法檢測RMP和INH耐藥性的敏感度、特異度均高于S和EMB，是否與樣本量及藥物濃度有關，有待于進一步證實。

在本研究中，我們用市售的OADC添加劑刺激MTB的生長，用PANTA抗菌素混懸液減少污染率，獲得了良好的效果，但這兩種添加劑均為進口，增加了檢測費用，應進一步摸索價廉的，易于獲得的上述兩種添加劑的替代品。本研究結果表明，NRA法直接檢測痰標本中MTB耐藥性快速、簡便、價廉，靈敏度和特異性較高，且觀察結果直觀，不需特殊儀器設備。

1 WHO.Global Tuberculosis Control：Surveillance，Planning，Financing，WHO report 2007，WHO/HTM/TB/2007.376.Geneva：World Health Organization，2007.

2 Aziz MA，Wright A，Laszlo A，etal.Epidemiology of antituberculosis drug resistance(the Global Project on Anti-Tuberculosis Drug Resistance Surveillance)：an updated analysis.Lancet，2006，368：2142-2154.

3 WHO.The WHO/IUATLD global project on antituberculosis drug resistance surveillance.Antituberculosis drug resistance in the world，report no.3.WHO/HTM/TB/2005.349.Geneva：World Health Organization，2004.

4 Affolabi D，Odoun M，Martin A，etal.Evaluation of direct detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance by a nitrate reductase assay applied to sputum samples in Cotonou，Benin.JClin Microbiol，2007，45：2123-2125.

5 Solis LA，Shin SS.Validation of a rapid method for detection of M.tuberculosis resistance to isoniazid and rifampin in Lima，Peru.Int J Tuber Lung Dis，2005，9：760-764.

6 Syre H，Valvatne H，Sandven P，etal.Evaluation of the nitrate-based colorimetric method for testing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to streptomycin and ethambutol in liquid cultures.JAntimicrob Chemother，2006，57：987-991.

7 中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006：46-49.

8 Syre H，Phyu S，Sandven P，etal.Rapid colorimetric method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin in liquid cultures.J Clin Microbiol，2003，41：5173-5177.

9 Goloubeva V，Lecocq M，Lassowsky P，etal.Evaluation of mycobacteria growth indicator tube for direct and indirect drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from respiratory specimens in a Siberian prison hospital.J Clin Microbiol，2001，39：1501-1505.