血必凈對創傷失血性休克大鼠腸組織中活性氧的影響

安建華 趙軍魁 王云輝

隨著現代社會經濟的發展，各種致傷因素不斷增加，創傷已成為臨床上常見的疾病，據統計，創傷是45歲以下人類死亡的第1位原因，是所有人類死亡的第3位原因［1］。而現代創傷的一大特點就是創傷患者大多都伴有創傷-失血性休克，因此對其研究成為現代醫學研究的熱點。目前，對于創傷失血性休克尤其是重癥創傷失血性休克尚無有效的救治方法，其傷亡率和致殘率很高，嚴重威脅人類生命和生存質量。本研究通過建立大鼠重度創傷-失血性休克模型，通過常規的乳酸林格氏液復蘇以及應用血必凈注射液復蘇進行比較，以期為臨床上救治創傷-失血性休克患者提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠56只(由北京軍事醫學科學院提供)，體質量220～270 g，隨機分為3組：假休克組(A組，n=8)，動物只分離組織并行血管插管，不進行放血及造成骨折，穩定10 min后開始取血液;乳酸林格氏液復蘇組(B組，n=24)：模型制作成功后，將血液回輸并輸入兩倍量的乳酸林格氏液進行復蘇，在30 min內給完。血必凈治療組(C組，n=24)：血必凈4 ml/kg(天津紅日藥業)加入乳酸林格氏液，余同上組復蘇，待實驗大鼠蘇醒后放入籠中自由進食進水，再按時間段分為復蘇后6 h、12 h、24 h，到時間點，麻醉大鼠后打開腹腔距回盲部5 cm處取10 cm小腸組織冰凍，制備成小腸勻漿，檢測腸組織中丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量，最后做統計學分析。

1.2 創傷失血性休克模型制作 實驗前12 h禁食、不禁水。實驗動物稱重后用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，分離右側股動、靜脈分別行插管術，股動脈用于放血及監測血壓，股靜脈用于補液。用骨鉗致大鼠左股骨干中下1/3處粉碎性骨折(無明顯外出血)。然后經右股動脈導管緩慢放血，在10 min內使大鼠平均動脈壓(MAP)降至(35±5)mm Hg，其間根據大鼠血壓的上下波動繼續放血或經股靜脈回輸少量血液，并將此動脈血壓值維持90 min，完成大鼠創傷-失血性重度休克模型［2］。

1.3 檢測指標

1.3.1 小腸勻漿的制備：稱取凍存的組織200 mg，用眼科小剪盡快剪碎，將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，加入1.8 ml冷0.9%氯化鈉溶液，用組織勻漿機制備，勻漿時間10 s/次，間隙30 s，連續3～5次，以上操作都在冰水中進行。將制備好的勻漿用低溫低速離心機3 000 r/min左右離心10～15 min，取上清備用。

1.3.2 小腸勻漿中MDA的測定：測定原理：過氧化脂質降解產物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測定方法嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作(過程略)。

1.3.3 小腸勻漿中SOD的測定：測定原理：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基(O2-)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色機的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計測得其吸光度。當被測樣品中含有SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測氧品中的SOD活力。測定方法嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作(過程略)。

1.4 統計學分析應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，計量資料采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小腸勻漿中MDA 大鼠休克后復蘇2組腸組織中的MDA含量與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);加用血必凈注射液復蘇，其腸組織中MDA的含量較單純應用乳酸林格氏液復蘇有所下降，但各時間點的數值仍高于對照組(P ＜0.05)。見表1。

表1 3組小腸組織中MDA的含量比較nmol/mgprot，±s

表1 3組小腸組織中MDA的含量比較nmol/mgprot，±s

注：與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

2.2 小腸勻漿中SOD 休克后復蘇2組腸組織中的SOD含量與對照組比較都有統計學意義，均出現明顯的下降(P＜0.05);加用血必凈注射液復蘇，其腸組織中SOD的含量較單純應用乳酸林格氏液復蘇有所升高，但各時間點的數值仍低于對照組(P ＜0.05)。見表2。

表2 3組小腸勻漿中SOD活力比較nU/mgprot，±s

表2 3組小腸勻漿中SOD活力比較nU/mgprot，±s

注：與A組比較，*P ＜0.05;與B組比較，#P ＜0.05

2.3 3組動物病死率的比較 實驗過程中A組無動物死亡，其余各試驗組動物均有動物死亡，C組較B組死亡率在12 h、24 h降低(P ＜0.05)。見表3。

表3 3組動物死亡率比較只(%)

3 討論

創傷失血性休克是指創傷引起全身組織血液灌流量不能滿足機體需要的病理生理過程。其機制較為復雜，創傷后產生的多種細胞因子對創傷后的進程有著至關重要的影響［3］，隨著對腸道黏膜屏障功能的進一步深入研究，人們發現在休克的發生發展過程中，腸道作為應激的“中心器官”“啟動器”［4，5］，起著非常重要的作用。休克的發生可導致腸道黏膜屏障的損傷，而腸道粘膜屏障的損傷可進一步加重休克，防止休克時腸道黏膜屏障的損傷對抗休克治療起到非常重要的作用。

研究發現，缺血再灌注損傷是失血性休克后腸道損傷的主要機制之一，正常情況下，胃腸道血流占心排出量的15% ～20%，當休克處于休克代償期時機體為保證重要器官的功能，交感神經髓質系統興奮，而腸道對兒茶酚胺敏感性較高，腸道黏膜血管收縮，血流下降，并且由于腸黏膜絨毛小血管成“發卡”狀［6］，血液易從小靜脈短路進入小靜脈，引起腸粘膜缺血。在失代償期腸道微循環淤血進一步加重了胃腸道缺血、缺氧狀態。有研究發現，胃腸道的血流量不僅下降的早而且恢復晚［7，8］，當缺血的腸道恢復血流再灌住后，次黃嘌呤-黃嘌呤系統被激活，產生大量有毒性的活性氧代謝產物(Reactive Oxygen Species，ROS)，包括超氧陽離子(O-)，過氧化氫(H2O2)，羥自由基(OH-)等，這樣物質可損傷腸黏膜細胞的核酸、蛋白質、脂質，使細胞通透性增加，導致細胞功能障礙，而腸組織富含黃嘌呤氧化酶，因而所受損傷更重。一旦體內 ROS的平衡被破壞，將導致ROS的過量產生，繼而引起組織結構和功能變化 因此，減少腸道分泌ROS，可能使腸道細胞減少損害減輕腸道的通透性，從而降低腸道細菌移位，避免進一步發展為腸源性多臟器功能衰竭(MODS)。所有的活細胞中均可產生氧自由基，但過量的氧自由基則對機體有害，故正常機體內存在一套有效的抗氧化防御系統可以清除氧自由基及其代謝產物，如過SOD，GSH，GSHPx，它們的變化反映了體內的抗氧化功能，可以反映機體清除氧自由基的能力;丙二醛(MDA)則是反映機體內活性氧含量高低的較好指標。SOD是超氧陰離子自由基(O2-)的特異性清除酶，通過歧化反應使O2-生成過氧化氫，后者在過氧化氫酶的作用下生成水。因此，SOD可阻止氧自由基鏈式反應的擴大，可以認為它是生物體內氧自由基清除系統的重要防線［9］。

本試驗選用SOD、MDA作為活性氧損傷的指標。SOD活性的下降及MDA水平的上升是活性氧損傷的證據，二者結合分析有助于判斷脂質過氧化及再灌注損傷程度。B、C組 MDA在休克復蘇后時開始升高，24 h達到高峰，表明休克后盡管給予有效的液體復蘇，腸道缺血再灌注引起的活性氧仍在繼續升高。

血必凈注射液的主要成分為赤芍藥、川芎、丹參、紅花、當歸等活血化瘀藥。活血化瘀中藥可通過消除超氧自由基，改善缺血再灌注損傷途徑遏制炎癥細胞浸潤［9］。有研究發現，赤芍藥、川芎、丹參等可抑制局部脂質過氧化反應，提高抗氧化酶活性［10，11］。

本實驗觀察到在乳酸林格氏液復蘇后大鼠血漿中的MDA仍然維持較高的水平，說明此時由于腸道缺血再灌注，炎性介質的大量釋放，導致腸道細胞內活性氧含量增高，增加了腸道的通透性，而血必凈在復蘇后下降，同時抗氧化物SOD較單純應用乳酸林格氏液復蘇各時間點均升高，提示血必凈注射液具有減少炎性介質釋放，抑制活性氧的作用，從而降低了腸道通透性，減輕了腸道的進一步損傷。

但本試驗也發現在乳酸林格氏液復蘇的同時加用血必凈后的大鼠死亡率與單純應用乳酸林格氏液復蘇的病死率明顯降低，提示在創傷-失血性休克后機體的病生理變化機制非常復雜，單純應用一種藥物可能起的作用不是很大，可考慮多種藥物聯合應用可能更有價值。

1 Fu WJ，Teng QS，Li TS，etal.Fluid resuscitation in traumatic shock.Chin Crit Care Med，2003，15：739-741.

2 孫英剛，黃宗海，馮浩森，等.創傷性休克大鼠模型的建立.解放軍醫學雜志，2002，27：1782.

3 郭培培，陳仲清，席小麗，等.腸道蛋白酶在失血性休克大鼠炎癥反應中的作用.南方醫科大學學報，2011，31：1086-1089.

4 Gonser S，Crompton NE，Weber PJ，etal.TP5 triggers signal transduction involving mitogen activated protein kinases in monotyters.J Recept Signal Transduct Res，1999，19：155-156.

5 張連陽，王正國，朱佩芳，等.大鼠失血性休克復蘇后腸屏障功能障礙.世界華人消化雜志，2001，9：767-770.

6 彭光宇主編.局部解剖學.第5版.北京.人民衛生出版社，2001.85-86.

7 Secchi A，Ortanderl JM，Schmidt W，etal.Effect of endotoxe mia on hepatic portal and sinusoidal blood flow in rats.JSurg Res，2000，89：26-30.

8 Deith EA.Intestinal permenabiity is increased in burn patients shortly after injury.Surgery，1990，107：411-416.

9 Valko M，Leibfritz D，Moncol J，etal.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.Int J Biochem Cell Biol，2007，39：44-84.

9 Chang RC，Rota C，Glover RE，etal.A novel effectofan opioid rece-ptorantagonist，naloxone，on the production of reactive oxygen spec-ies by microglia：study by electron paramagnetic resonance spectros-copy.Brain Res，2000，854：224-229.

10 崔乃杰，石學敏主編.中西醫臨床急癥學.第1版.北京：中國中醫藥出版社，2008.24-27.

11 王擁軍，何士大.抗氧化中藥的研究現狀.中國中西醫結合雜志，2006，16：312.