薤白對絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠的作用及機制研究*

吳相鋒，李 錚，來 靜，吳相春，，賈振華，，王宏濤，王玲玲

(1.河北醫科大學附屬以嶺醫院(國家中醫藥管理局中醫絡病學重點學科，石家莊 050091);2.國家中醫藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，石家莊 050035;3.石家莊市第三醫院，石家莊 050017)

薤白為百合科蔥科植物小根蒜Allium macrostemonBunge和薤Allium chineseG·Don的干燥鱗莖，味辛、苦，性溫、無毒，具有溫中通陽、暢通絡氣、寬胸散結之功效，為胸痹心痛之要藥。現代研究表明，薤白的化學成分構成含有多種活性成分，主要含大蒜氨酸、甲基大蒜氨酸、大蒜糖，醇提取物含有前列腺素。具有抑菌消炎、解痙平喘、抗血小板聚集作用，以及抗氧化作用、降低血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、鎮痛作用［1］。本研究觀察了薤白提取物對絡氣郁滯型血管內皮功能障礙大鼠血管內皮功能、結構及主動脈組織內質網標志性蛋白葡萄糖調節蛋白78(GRP78)的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級Wistar雄性大鼠30只，體質量200～230g，購于北京維通利華實驗動物中心(許可證號SCXK(京)2007-0001)。

1.1.2 藥物 薤白提取物:由河北以嶺醫藥研究院提供，用0.5%CMC-Na配制成0.12g生藥/ml的混懸液，4℃保存備用;蛋氨酸由河北省農科院提供，并由河北省實驗動物中心制作成3%的高蛋氨酸飼料，純度 99.9%(批號 B7NE-05-0007-MC02);血清一氧化氮(NO)試劑盒由南京建成生物試劑公司提供，血漿內皮素(ET)由北京普爾偉業生物科技有限公司提供，Goldview為賽百盛公司產品，BCA法蛋白濃度定量試劑盒、ECL發光檢測試劑盒由Pierce公司提供。抗大鼠GRP78/Bip多克隆抗體由Cell Signaling提供。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 清潔級雄性Wistar大鼠30只，將大鼠按體質量隨機分為空白對照組、絡氣郁滯型血管內皮功能障礙組(以下簡稱模型組)和薤白組3組。參照本室的方法［2］，實驗開始時即將大鼠放入束縛盒內，調節前端活動部位到合適的位置，使大鼠不產生強烈反抗的緊張程度，每天6h，給予3%蛋氨酸飲食，時間為6周。空白對照組給予正常飲食。

1.2.2 給藥 實驗第1天薤白組給予薤白1.2g生藥/(kg·d)灌胃，用0.5%CMC-Na溶液配制成混懸液，其余2組按體質量灌服0.5%CMC-Na溶液。各組喂食飼料不變，實驗共6周，每周6次。

1.2.3 標本采集 實驗末10%水合氯醛麻醉，頸動脈取血后，迅速剪開胸腔分離胸腹主動脈，于主動脈弓處取一段血管置于4%多聚甲醛溶液中固定，以備HE染色，光鏡觀察。仔細分離并截取一小段動脈，預冷生理鹽水沖洗，迅速浸入電鏡液中，修成1mm×1mm×1mm大小組織塊，迅速置于2.5%的戊二醛固定液，用于透射電鏡觀察;每組3只大鼠無菌取主動脈組織迅速投入液氮中，然后于－80℃凍存待測GRP78的表達。

1.2.4 血清NO、血漿ET的檢測 分離血清、血漿后凍存，硝酸還原酶法檢測血清NO(白求恩國際和平醫院完成)，放免法檢測血漿ET-1(解放軍總醫院完成)。

1.2.5 光鏡組織學觀察 常規HE染色，光鏡觀察。

1.2.6 透射電鏡組織學觀察 經1%的鋨酸固定、割斷、酒精逐級脫水、臨界點干燥和離子金屬鍍膜，用日立 H-7500透射電鏡觀察、拍照(河北醫科大學電鏡室完成)。

1.2.7 Western blot法測定GRP78的表達 取血管組織經液氮研磨后加入1ml RIPA裂解液冰上裂解 30min，4℃、3000rpm離心 20min吸取上清，BCA法測定總蛋白濃度，用樣品緩沖液稀釋至7.5ug/ul。取 150ug蛋白樣品進行 12%的 SDSPAGE凝膠電泳，待溴酚藍接近凝膠底部時停止電泳，4℃、120V恒壓電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉 1h。分別加入1∶750稀釋的 GRP78/Bip一抗和1∶500稀釋的 β-actin(內參)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜10min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)室溫孵育 1h，TBST洗膜5min×3次。ECL發光顯色，凝膠成像系統照相，實驗結果采用Quantity One軟件分析，掃描灰度值，以目的蛋白與內參β-actin的比值表示。

2 結果

2.1 各組大鼠之間ET、NO的變化

表1顯示，與正常對照組比較，復合模型組大鼠血漿ET明顯升高，血清NO明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。與復合模型組比較，薤白組大鼠的 ET水平明顯降低，NO水平明顯升高(P＜0.01)。

表1 各組大鼠 ET、NO水平的變化比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠 ET、NO水平的變化比較(±s，n=10)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組 別 ET(pg/ml) NO(umol/L)正常組142.91± 8.72 45.22±12.42模型組 178.25±21.85＊＊ 24.91± 9.95*薤白組 153.47± 9.36## 56.12±21.30##

2.2 形態學觀察

2.2.1 各組大鼠主動脈組織光鏡的變化 圖1顯示，正常組主動脈內膜、中膜、外膜形態基本正常，結構完整。模型組內皮細胞腫脹、分布不均勻、密度增加，內膜有多量淋巴細胞附壁，內膜內有炎細胞浸潤，內彈力板有斷裂，平滑肌可見明顯水腫。薤白組可改善模型大鼠的主動脈大體形態。

圖1 各組大鼠主動脈組織HE染色變化比較(×400)

2.2.2 各組大鼠主動脈內皮細胞超微結構的變化 圖2顯示，正常組內皮細胞形態規則，細胞核及細胞器存在，線粒體結構無異常。模型組內皮細胞線粒體大部分嵴和少部分膜融合或消失，幾乎見不到粗面內質網和吞飲小泡。薤白組可改善模型大鼠主動脈組織內皮細胞的超微結構。

圖2 各組大鼠主動脈組織內皮細胞超微結構變化比較(×20000)

2.3 各組大鼠主動脈組織GRP78蛋白表達變化

圖3顯示，與正常組比較，模型組主動脈組織GRP78蛋白表達顯著增強(P＜0.05)。與模型組比較，薤白組GRP78蛋白表達量明顯降低(P＜0.05)。

圖3 各組之間GRP78表達變化

3 討論

血管內皮細胞在維持血管正常功能方面起著重要作用，內皮細胞不僅是血液和組織間進行交換的屏障，而且可合成和分泌多種生物活性物質，如NO、ET。NO/ET是一對具有拮抗效應的血管活性物質，兩者合成釋放作用的協調是維持血管張力的主要因素之一。高同型半胱氨酸(HHcy)血癥是血管內皮功能障礙的危險因素，Hcy的氧化應激反應在很大程度上解釋了Hcy誘導的內皮功能損害，然而同樣是含硫氨基酸，半胱氨酸在體內的濃度遠高于Hcy水平，雖然半胱氨酸也能產生活性氧物質，但并不引起內皮細胞損傷。抗氧化劑如N-乙酰-L-半胱氨酸、維生素C、E和過氧化氫酶等均不能抑制Hcy誘導的內皮細胞凋亡，這提示可能存在除氧化應激外的其他機制介導Hcy誘導內皮細胞損傷。不少學者提出內質網應激學說［3］，在心血管系統中，內質網應激作為多種應激過程的共同通路，廣泛地參與多種心血管疾病的發生。有研究發現，在培養的血管內皮細胞中，HHcy誘導的內質網應激激活［4］。GRP78是一重要的內質網分子伴侶，當內質網應激發生時，GRP78作為一種代償而增多，促進蛋白質的折疊。Hcy引起嚴重或長期的內質網應激可以使一些參與血管病變形成的分子功能紊亂，其中包括脂質代謝、細胞凋亡和炎癥的調節障礙［5］。絡氣郁滯證候能造成明顯的內皮功能障礙，可能與主動脈組織內質網應激有關［6］。

本研究應用慢性束縛法與3%蛋氨酸飲食相復合建立絡氣郁滯型血管內皮功能障礙病證復合動物模型，并用流氣暢絡藥薤白提取物進行預防性干預。結果顯示，模型組血清NO含量明顯下降，血漿ET明顯升高，主動脈組織形態及內皮細胞超微構發生明顯改變，GRP78蛋白表達明顯增強。薤白提取物可明顯降低復合模型大鼠血漿 ET水平，升高血清NO水平，抑制主動脈組織GRP78蛋白的表達。實驗表明，模型大鼠存在明顯的血管內皮功能障礙和主動脈組織內質網應激，薤白提取物能改善模型大鼠的血管內皮功能，明顯抑制主動脈組織的內質網應激。提示薤白提取物可能通過降低模型大鼠主動脈組織GRP78蛋白的表達，抑制模型大鼠的內質網應激來改善模型大鼠血管內皮功能，防止血管內皮細胞受損，詳細機制有待于進一步探討。

［1］吳以嶺.絡病學［M］.北京:中國科學技術出版社，2005:415-418.

［2］吳相春，吳以嶺，賈振華，等.絡氣郁滯型內皮功能障礙大鼠動物模型的建立和評價［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2008，14(1):30-32.

［3］嚴江濤，汪道文.同型半胱氨酸與血管內皮功能失調的關系及其分子機制的研究進展［J］.臨床心血管病雜志，2004，20(4):254-256.

［4］婁利霞，唐朝樞.內質網應激與心血管疾病［J］.中國分子心臟病學雜志，2005，5(2):496-499.

［5］王曉紅，張衛光，林勝利，等.四氯化碳誘導性肝硬化大鼠肝組織葡萄糖調節蛋白78表達的研究［J］.解剖學報，2006，37(13):290-293.

［6］吳相春，來靜，李愛然，等.絡氣郁滯證大鼠主動脈組織葡萄糖調節蛋白78mRNA表達的研究［J］.北京中醫藥，2010，29(6):449-451.