紫杉醇與雷帕霉素復合藥物涂層支架預防冠脈再狹窄動物實驗研究

王浩 李泱 張文輝 高偉 栗競 李曉英 文毅 徐占穩 茍鵬 黃麗潔

冠狀動脈內支架植入術是冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)的主要手段，而藥物涂層支架(Drugelutingstent，DES)能顯著的降低支架置入術后的再狹窄和再次血運重建率，成為冠心病PCI發展史上新的里程碑。近年來，DES的研究主要集中在涂層載體、涂層藥物及涂層工藝的研究上。涂層藥物的研究有較快發展，但目前應用于臨床最多的還是抗增殖藥物紫杉醇與雷帕霉素。采用納米技術涂層是近年新興的支架涂層技術，具有生物相容性好、機械穩定性強的優點［1］。本研究觀察一種新型的采用納米技術涂層的紫杉醇與雷帕霉素復合藥物涂層支架預防冠脈內再狹窄的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選用小型豬6頭，均為雄性，體重17～20 kg。支架分為：A支架，中劑量紫杉醇+低劑量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇45.75μg、雷帕霉素58.5μg;B支架，中劑量紫杉醇+中劑量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇56.5μg、雷帕霉素123μg;C支架，低劑量紫杉醇+高劑量雷帕霉素，平均每枚支架含紫杉醇19.5μg、雷帕霉素417μg。

1.2 方法 小型豬喂飼1周適應環境，每頭豬于術前3 d起口服阿司匹林，100 mg/d，硫酸氯吡格雷，25 mg/d。應用中國農業大學生產的“豬麻醉劑”進行全身麻醉(1 ml/10 kg)，抽血，穿刺，置入動脈鞘，動脈鞘內注入肝素全身肝素化，選擇右冠狀動脈，采用國際上公認的小型豬冠狀動脈過度擴張的再狹窄模型［2］。測定血管直徑，根據參考血管直徑，用球囊以球囊/血管1.3∶1的比例，用10～15個大氣壓15 s單次過度擴張血管形成冠狀動脈損傷模型，植入支架，球囊擴張壓力為10個大氣壓×10 s，間隔1 min后在原部位12個大氣壓×10 s擴張。支架置入后重復冠狀動脈造影以確定冠狀動脈是否通暢。術后予以青霉素320萬U、阿司匹林、氯吡格雷，繼續喂飼6周。

1.3 冠脈造影判斷冠脈再狹窄情況 術后6周麻醉，肝素化，進行右冠狀動脈造影。2次造影術后抽血檢測肝、腎功能。

1.4 組織間苯二酚品紅染色法觀察冠脈再狹窄情況 放血處死后取出心臟，保留部分升主動脈，4%多聚甲醛100 mm Hg加壓灌注15 min，分離并取出含支架段血管，多聚甲醛固定48 h后，支架部位塑料包埋，組織學切片，HE染色，標本切片，Olympus顯微鏡拍照。組織學切片的橫截面積由Image-Pro Plus專業圖像分析軟件(版本：5.0.2)進行形態測量與分析。標尺定標，隨后測量以下指標：管腔面積(luminal area，LA)，即內膜包繞面積;內彈力板圍繞面積(internal elastic lamima area，IELA)，內彈力板完整時通過內彈力板內緣測定，內彈力板斷裂者以斷裂處的中膜為邊界，中膜亦斷裂時以外彈力板為邊界;外彈力板圍繞面積(external elastic lamima area，EELA)，外彈力板內緣包繞的面積總和;中膜面積(media area，MA)，MA=EELA-IELA;新生內膜面積(neointima area，NIA)，NIA=IELA-LA;管腔狹窄程度(percent area stenosis，PAS)，PAS=LA/IELA ×100%。每個支架切片4～5張，分別測量后求均值。

2 結果

2.1 植入支架情況 6頭豬存活4頭，每頭存活豬均在右冠狀動脈內成功植入2枚支架，共在右冠狀動脈內植入支架8枚。有2頭豬術中發生室顫，死亡。見表1。

表1 植入支架一般情況

2.2 術前、術后生化結果 4只豬術前、術后各項生化指標無明顯變化。見表2。

表2 術前、術后生化結果

2.3 造影情況 前后造影對比示1枚A支架內可見輕度狹窄，余各支架內均未見明顯狹窄及閉塞病變。

2.4 病理結果 6周之后1枚A支架內發生狹窄，其血管管腔面積(LA)與其他A支架及B、C支架相比，明顯減小(P＜0.05)，內彈力板圍繞面積(IELA)、外彈力板圍繞面積(EELA)及中膜面積(MA)無明顯變化，新生內膜面積(NIA)裸支架組比A、B、C組支架明顯增大(P ＜0.05)，管腔明顯狹窄(P ＜0.05)。見表3、圖1。

2.5 鏡下觀察狹窄A支架內膜增生明顯，管腔明顯狹窄，余A支架及B、C支架血管內膜無明顯增生，管腔無明顯狹窄。見表3，圖 2、3。

表3 支架植入術后6周動脈形態學變化±s

表3 支架植入術后6周動脈形態學變化±s

注：與狹窄A支架比較，*P＜0.05

支架(n=2) 0.55±0.09 0.09±0.0285.9±7.76 C支架(n=2) 0.49±0.22* 0.58±0.06 1.25±0.11 0.67±0.06 0.09±0.01* 84.5±10.77*

3 討論

DES的問世被譽為介入心臟病學領域的又一個“里程碑”，其有效性充分體現在能夠顯著降低再狹窄率方面。DES是將藥物通過適當的方法涂布于支架表面，使之形成一個藥物池，在血液的沖刷和溶解作用下，藥物不斷從支架表面洗脫，并在局部發揮作用。DES是支架、藥物載體和涂層藥物三者結合應用的產物，而涂層藥物的選擇是DES的核心。根據主要藥理作用的不同，將涂層藥物分為抗血栓藥物、抗炎癥藥物、抗血管平滑肌細胞(VSMC)增殖藥物、抗VSMC移行藥物、促內皮愈合藥物五大類，抗VSMC增殖藥物是目前最受關注的一類藥物，研究較多的包括雷帕霉素和紫杉醇等。雷帕霉素與紫杉醇作用機制完全不同，作用于細胞發育周期的不同階段。雷帕霉素是一種細胞靜止藥物，體外研究結果提示能明顯抑制大鼠和人血管平滑肌細胞的增殖［3］，其機制是阻斷平滑肌細胞表面受體后的信號傳導，使細胞增殖停止于細胞周期的G1晚期，阻斷細胞周期G1期向S期的轉變，從而抑制細胞增殖［4］。紫杉醇是臨床常用的一種抗腫瘤藥物，它的微管聚合作用能使細胞產生穩定而無功能的微管，低劑量時抑制細胞G0/G1期轉變，高劑量時引起細胞M期阻滯，致細胞凋亡，可有效地抑制血管平滑肌細胞增殖、移形和基質形成［5］。

近年報道的復合藥物涂層支架包括雷帕霉素-巴曲酶復合藥物涂層支架［6］、雷帕霉素-替羅非班復合涂層［7］、雷帕霉素和甲氨蝶呤復合涂層［8］、雷帕霉素-纈沙坦復方藥物洗釋支架［9］。這些復合涂層應用的一般是不同作用機制的兩種藥物，而有關雷帕霉素與紫杉醇二者復合涂層的研究筆者尚未見報道。

本研究中支架載藥量的確定參考了進口DES。美國BOS TON公司生產的TAXUS支架的紫杉醇含量為1.0μg/mm，最大型號支架(3.50×32 mm)的最高標稱藥物總含量為224μg，美國強生公司生產的CYPHER支架的雷帕霉素含量為140μg/cm，最大型號支架(4.00×33 mm)上的最大藥量為419μg。本研究觀察了三種劑量組合的復合涂層支架對6周后豬冠狀動脈再狹窄的預防作用，以期尋找到一種合適的劑量組合，既可以減少涂層藥物劑量，又可以起到充分的抑制新生內膜增生、預防支架內再狹窄的作用。結果顯示除一枚中劑量紫杉醇+低劑量雷帕霉素支架發生了明顯的再狹窄、內膜明顯增生外，余支架均無明顯再狹窄，提示中劑量紫杉醇+中劑量雷帕霉素及低劑量紫杉醇+高劑量雷帕霉素的組合可以完全預防短期內冠脈再狹窄，而中劑量紫杉醇+低劑量雷帕霉素的組合的有效性尚待進一步檢驗。

納米藥物是指以納米級高分子載體與藥物以一定方式結合在一起后制成的藥物，也可以是直接將原料藥物加工制成的納米粒，其粒徑可能超過100 nm，但通常應小于500 nm。納米藥物的粒徑使它具有非凡的表面效應和小尺寸效應，與常規藥物相比，它顆粒小、表面反應活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強。因此，納米藥物具有能夠提高生物利用度，減少用藥量，減輕或消除不良反應的特點。既往已有納米顆粒載藥涂層支架研制成功的報道［10］，為PES的研究開拓了新的思路，隨著研究的不斷深入，納米PES可能會給治療血管內再狹窄帶來更好的效果［11］。

圖1 不同支架血管病變情況

圖2 不同支架血管管腔狹窄程度

圖3 6周后血管橫斷面(HE×40)

1 Tsujino I，Ako J，Honda Y，Fitzgerald PJ.Drug delivery via nano-，micro and macroporous coronary stent surfaces.Expert Opinion on Drug Delivery，2007，4：287-295.

2 Willette RN，Zhang H，Louden C，et al.Comparing porcine models of restenosis.In Tumbleson ME，and Schook LB(eds)，Advances in swine in biomedical research.New York：Plenum Press，pp，1996.595-606.

3 Mohacsi PJ，Tuller D，Hulliger B，et al.Different inhibitory effects of immunosuppressive drugs on human and rat aortic smooth muscle and endothelial cell growth factor.JHeart Lung Transplant，1997，16：493-495.

4 Polyk K，Lee MH，Erdjument B，et al.Cloning of P27，a cyclin-depent kinase inhibitor and a potential mediater of extracellular antimitogenicsignals.Cell，1994，78：59-66.

5 Axel DI，Kunert W，Goggelmann C，et al.Paclitaxel inhibits arterial smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and in vivo using local drug delivery.Circulation，1997，96：636-645.

6 陳丹，呂安林，張薇，等.雷帕霉素-巴曲酶復合藥物涂層支架預防支架內再狹窄的實驗研究.心臟雜志，2007，19：185-188.

7 刁繁榮，呂安林，李軍杰，等.雷帕霉素-替羅非班復合藥物涂層支架預防支架內血栓和再狹窄的實驗研究.心臟雜志，2007，19：384-387.

8 徐衛亭，霍勇，陳明，等.雷帕霉素和甲氨蝶呤涂層支架預防支架內再狹窄的實驗研究.中國介入心臟病學雜志，2004，12：99-102.

9 陳津，陳紀言，李光.雷帕霉素-纈沙坦復方藥物洗釋支架預防支架內再狹窄的實驗研究.嶺南心血管病雜志，2002，8：421-424.

10 倪中華，易紅，王躍軒，等.預防心血管再狹窄納米顆粒載藥涂層支架的研究.東南大學學報(自然科學版)，2004，34：789-793.

11 趙蘇蘇，張東生，盧勤.血管內藥物涂層支架制備及應用的研究進展.東南大學學報(醫學版)，2007，26：378-381.