胚胎致死性異常視覺蛋白HuR在卵巢上皮性癌表達及預后

齊玉明 成艷梅 王振芬 李研 石彬

卵巢惡性腫瘤在女性生殖器官惡性腫瘤中的發生率占第三位，但其病死率卻居第一位。卵巢癌發病隱匿，70%的患者診斷明確時已是臨床晚期。雖然，多年來外科手術操作技術、化療方案不斷改進，仍不能改善卵巢癌的生存率，5年生存率始終徘徊在30%左右。因此，尋找新的防治方法，提高患者5年的生存率是急需解決的問題。HuR是RNA結合蛋白中胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家族的一員，ELAV家族是最緊密的RNA結合蛋白。HuR廣泛存在于幾乎所有的增殖細胞中，通過一定的信號途徑參與細胞的增殖、分化等多種細胞行為的調節。人體內有多種細胞可分泌HuR，但在一些正常組織中表達水平很低，而在許多惡性腫瘤組織中表達水平增高，且與預后不良有關。本研究旨在檢測HuR在卵巢上皮性癌的表達，對卵巢癌的防治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2005年6月至2010年8月，在河北醫科大學第二學院婦科因卵巢上皮性癌而接受手術治療的患者68例，術前均未接受放療、化療、激素及免疫治療，術后病理組織學診斷明確，平均年齡52歲。按照WHO(1973)標準將研究對象進行組織學分類及分級，其中包括漿液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宮內膜癌6例;病理分級：高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴結轉移者30例，無淋巴結轉移者38例;按照2000年FIGO臨床分期標準，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;選擇同期交界性卵巢腫瘤10例(漿液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宮+雙附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：腫瘤切下后，從腫瘤生長活躍、無壞死的邊緣部位取下約1 cm3大小的組織2塊，放入100 mmol/L甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化測定。

1.2.2 免疫組化法檢測HuR的表達：標本常規脫水，石蠟包埋并制成4μm厚的連續切片，經HE染色判斷切片質量后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，在同一時間、同一條件下進行免疫組化檢測。兔抗人多克隆HuR抗體為Santa Cruz產品，兔SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。染色步驟按SP試劑盒(北京中杉金橋試劑公司)說明書進行，微波修復抗原，一抗滴度為1∶200。磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗做陰性對照。取表達最強的部分，按著色程度分為基本未著色，染色與背景相似者為0分;著色淺，高于背景為1分;中度著色，明顯高于背景者為2分;強染，著色深棕黃色者為3分。隨機選取5個高倍視野，在400倍視野下連續記數100個細胞，陽性細胞數小于5%者為0，陽性細胞數5% ～25%計1分;26% ～50%計2分;51% ～75%計3分;76% ～100%計4分，兩種積分相加，積分為0～1分，表示陰性(-);積分為2～3分，表示陽性(+);積分為4～5分，表示陽性(++);積分為6～7分，表示陽性(+++)。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，等級資料的組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織胞核中的表達 卵巢上皮性癌組織中胞核HuR的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P＜0.01);交界性卵巢腫瘤胞核HuR的表達與正常卵巢組織比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 3組HuR陽性表達率比較 例

2.2 胞質HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達 卵巢上皮性癌組織中胞質HuR的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P＜0.05);胞質HuR的表達在交界性卵巢腫瘤與正常卵巢組織比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 3組胞質HuR陽性表達率比較 例

2.3 胞質HuR的表達與卵巢上皮性癌臨床病理學特征的關系 FIGO的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期胞質HuR的陽性表達率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)。組織分化高的卵巢上皮性癌胞質HuR的表達較中、低分化的表達弱(P＜0.05)，胞質HuR的表達在中分化與低分化之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 胞質HuR的表達與卵巢上皮性癌臨床病理學特征例(%)

3 討論

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表達的意義 HuR是RNA結合蛋白中胚胎致死異常視覺(embryonic lethal abnormal vision，ELAV)家庭的一員，又稱為類胚胎致死異常視覺蛋白 A。ELAV家庭是最緊密的RNA結合蛋白，最初是在果蠅中被發現。ELAV家庭共包括四個成員：HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和HuR。HuR幾乎在所有增殖的細胞中表達，而其他三個成員主要表達在終端分化的神經組織中。

HuR分子量為36 kD，許多早期反應基因的mRNAs在其3’非翻譯區(untranslated regins，UTR)有AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以與順式反應元件一起調節mRNAs的不穩定性。HuR可以與 AREs相互作用，AREs在調節細胞生長和分化以及免疫應答基因的表達中起關鍵作用，編碼細胞因子、淋巴因子及原癌基因的一類早期反應基因的mRNA均含有ARE，其mRNA通常在細胞外刺激的條件下短期轉錄，然后被迅速從細胞質清除。這類基因通常是即刻進行轉錄，與RNA結合蛋白結合的這種基因表達調控步驟，對于精確調控潛在有害的致炎因子和轉化因子有重要作用。目前，許多ARE結合蛋白被識別，HuR是其中一種。Nowotarski等［1］報道HuR的過表達不是增強mRNA降解，而是在瞬時轉染實驗中穩定mRNA。并且在轉染哺乳動物細胞后穩定包含AREs的mRNAs并使之過表達。本研究發現，HuR即可在胞核表達，也可在胞質表達。胞核HuR的表達在正常卵巢組織、交界性卵巢腫瘤組織和卵巢上皮性癌中陽性表達率呈遞增趨勢，且在卵巢上皮性癌中的表達明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織，而在交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中表達差異無統計學意義(P＞0.05)。胞質HuR的表達在正常卵巢組織、交界性卵巢腫瘤組織和卵巢上皮性癌中陽性表達率也呈遞增趨勢，且卵巢上皮性癌中的表達與交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而在交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中表達差異無統計學意義。提示，HuR的異常表達與卵巢癌的發生有密切關系。

3.2 HuR在胞質和胞核的表達及與臨床指標的關系 近來研究表明HuR可以在核質間穿梭［2］。Hu蛋白含有3個保守的RNA識別模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在 RRM2 和RRM3之間有鉸鏈區，該區內含一段包含52個氨基酸的HuR核質穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)區，對細胞定位和功能相當重要。可以先與包含ARE的mRNAs在細胞核內結合，然后與之一起進入細胞質，保護mRNAs避免其衰變降解，從而導致HuR在多種惡性腫瘤中表達上調。Jie等［3］研究表明HuR可以通過2種不同途徑進入細胞質。一種是需要4種蛋白配體(PP32，SETa，SETb和APRL)的依賴染色體區域維持蛋白質(chromosomal region maintenance protein1，CRM1)，另一種是非依賴CRM1而需要HNS，正是通過上述兩種機制，使HuR在核與質間穿梭，從而使HuR在胞核與胞質均有表達。但是，許多研究發現胞質HuR的表達與臨床病理參數和預后有關，未發現胞核HuR的表達與臨床病理參數和預后有關［4］。

本研究選擇了與卵巢上皮性癌關系最密切的五個臨床參數，分別是患者年齡、FIGO分期、病理類型、組織學分級和淋巴結轉移。研究結果顯示，胞質HuR的表達與腫瘤的組織學分級和臨床分期有關。胞質HuR在組織學分級1級(高分化)、2級(中分化)、3級(低分化)的陽性表達率分別為：10.00%、46.67%、57.14%，呈遞增趨勢，組織分化高的卵巢上皮性癌組織中胞質HuR的表達同中-低分化組的表達比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。FIGO臨床分期晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者胞質HuR的陽性表達率(56.09%)顯著高于早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者(29.63%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。本研究未發現胞核HuR的表達與臨床病理參數存在相關性。這與Erkinheimo等［5］報道的結果基本一致。作為 mRNA穩定因子的HuR蛋白在腫瘤細胞的胞質分布有其特殊的意義。推測胞質HuR的分布與腫瘤的發生發展有關。對于其胞質分布的機制，有待進一步的研究。提示惡性程度越高，臨床分期越晚，卵巢癌組織中胞質HuR的表達越強。

本研究未發現胞質HuR的表達與患者發病年齡與病理類型和淋巴結轉移有關。這與有的學者報道不相同。Denkert等［6］報道胞質HuR的表達與卵巢癌年齡有關，與病理類型和淋巴結轉移無關。Mrena等［7］報道，胞質HuR的表達與胃癌的發病年齡、性別和淋巴結轉移有關。可能與胞質HuR在不同腫瘤細胞分布不同和本實驗中樣本例數相對較少，造成實驗誤差有關，有待于增加樣本例數，改進實驗方法進一步證實。

已發現許多基因的mRNA可以與HuR結合，例如：COX-2、血管源性生長因子(如VEGF)、和免疫抑制細胞因子(如TGF、IL-6)等，均可促進腫瘤生長［8］。Grau 等［9］報道，在中樞神經系統(CNS)腫瘤中，血管內皮生長因子(VEGF)RNA轉錄子的穩定對于其表達上調是一種重要的分子途經，而HuR對上述基因具有轉錄后調控作用。提示，如果成功抑制HuR對上述基因的轉錄后調控作用，有可能抑制腫瘤的生長與轉移。

根據HuR蛋白在惡性腫瘤中的過表達和它的生物學功能，HuR蛋白抑制劑可對抗腫瘤致炎因子血管生成和腫瘤增殖，推測HuR抑制劑有望成為腫瘤分子治療的新靶點。目前，抑制HuR的RNA介導的治療已用于臨床［10］，我們期待在這一領域的研究能夠更加深入。

1 Nowotarski SL，Shantz LM.Cytoplasmic accumulation of the RNA binding protein HuR stabilizes the ornithine decarbo-xylase transcript in a murine non-melanoma skin cancer model.JBiol Chem，2010，8：1074.

2 Kim HH，Abdelmohsen K，Ashish Lal，et al.Nuclear HuR a-ccumulation through phosphorylation by Cdk1.Genes ＆ Dev，2008，22：1804-1815.

3 Jie Yi，Na Chang，Xinwen Liu，et al.Reduced nuclear export of HuR mRNA by HuR is linked to the loss of HuR in replicative senescence.Nucleic Acids Res，2010，38：1547-1558.

4 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65：2157-2161.

5 Erkinheimo TL，Lassus H，Sivula A，et al.Cytoplasmic HuR expression correlates with poor outcome and with cyclooxygenase-2 expression in serous ovarian carcinoma.Cancer Res，2003，63：7591-7594.

6 Denkert C，Weichert W，Pest S，et al.Overexpression of the embryonic-lethal abnormal vision like protein HuR ovarian cancinoma is a prognostic factor and is associated with increased cyclooxygenase-2 expression.Cancer Res，2004，64：189-195.

7 Mrena J，Wiksten A，Thiek A，et al.Cyclooxygenase-2 is an independent prognostic factor in gastric cancer and its expression is regulated by the messenger RNA stability factor HuR.Clin Cancer Res，2005，11：7362-7368.

8 Anke D，El-Sayed A，Andrea H，et al.Posttranslational Modification of the AU-Rich Element Binding Protein HuR by Protein Kinase C Elicits Angiotensin II-Induced Stabilization and Nuclear Export of Cyclooxygenase 2 mRNA.Mol Cell Biol，2008，28：2608-2625.

9 Grau SJ，Trillsch F，Herms J，et al.Expression of VEGFR3 in glioma endothelium correlates with tumor grade.J Neuro Oncol，2007，82：141-150.

10 Giessen K，Di-Marco S，Clair E，et al.RNA-mediated HuR depletion leads to the inhibition of muscle cell differentiation.JBiol Chem，2003，47：47119-47128.