TLR4在非酒精性脂肪性肝炎的表達及意義

竇 艷，邱 鵬，陳江偉

（邢臺市人民醫院，河北 邢臺054031）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是與內臟性肥胖、高血壓、胰島素抵抗和2型糖尿病相關的肝臟損傷為主的代謝性疾病。肝臟星狀細胞（HSCs）及枯否細胞（KC）的活化是其發生的關鍵因素之一，TLR4主要存在于各種免疫細胞，而TLR4主要識別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖（Lipolysaccharides，LPS），是LPS／TLR4信號傳導通路的重要因子，本研究旨在通過60例NASH患者肝穿組織TLR4的表達來探討TLR4在非酒精性脂肪性肝炎的作用，并研究其與星狀細胞的關系。

1 材料與方法

1．1 材料 材料來源：收集邢臺市人民醫院和邢臺市二院2000－2011年期間經過病理確診且臨床資料完整的NASH患者肝穿刺活檢標本60例，年齡13－70歲，平均36歲，其中男39例，女21例。另取10例正常肝組織標本作為對照。

主要試劑：兔抗人TLR4多克隆抗體、DAB顯色試劑購自福州邁新生物工程有限公司；鼠抗人α－SMA試劑盒購自北京中山生物有限公司。

1．2 方法 病理組織學觀察：石蠟包埋組織切片分別進行HE染色、網狀纖維染色、Masson三色染色，光鏡下觀察。依據1999年Brunt分級分期標準對上述標本進行分組。炎癥分級：G1（n＝11）、G2（n＝35）、G3組（n＝14）；纖維化分期：S1（n＝32）、S2（n＝23）、S3（n＝5）組；脂肪變性分級：F1（n＝13）、F2（n＝30）、F3（n＝17）組。

免疫組織化學染色：采用SP免疫組化染色法。參照試劑盒說明操作，α－SMA單克隆抗體（濃度1∶300）、TLR4多克隆抗體（濃度1∶300）。

免疫組化染色半定量分析：免疫組化染色有明確的棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。光鏡觀察陽性細胞在NASH肝組織內的分布并計數每視野陽性細胞數。每張切片選取5個以上典型匯管區和肝小葉，于200×視野下計算各組陽性細胞平均數，計算免疫組化陽性檢出率（%）。

1．3 統計學處理 采用SPSS13．0統計軟件對各組之間的差異進行χ2檢驗、Spearman秩相關分析等，取α＝0．05。

2 結果

2．1 α－SMA在肝穿組織中的表達 主要表達于活化的肝星狀細胞，細胞漿陽性。NASH肝組織中α－SMA的陽性細胞數與表達量表達隨著炎癥活動分級及纖維化分期的增加而增多，且呈正相關關系（P＜0．05）。

2．2 TLR4在肝穿組織中的表達 正常肝組織中TLR4的表達無或僅存在于極個別細胞中，主要位于庫否細胞及星狀細胞的胞膜及胞漿，在NASH組中，它們的表達均明顯高于正常對照組（表1）。連續切片免疫組化觀察，α－SMA表達的星狀細胞一部分表達TLR4。且TLR4在NASH組中的表達隨著炎癥活動程度分級和纖維化程度的升高而顯著增加，且呈正相關關系。（P＜0．05，表2）

2．3 TLR4與α－SMA在不同病例的相關性 在NASH的不同病例中，TLR4的表達與α－SMA呈正相關（r＝0．245，P＝0．005＜0．05）

表1 TLR4在正常及NASH患者肝組織內的表達

3 討論

隨著人們生活的改善、生活方式和飲食結構的改變，NASH的發病率逐年增高。已是公認的隱源性肝纖維化發生的重要原因之一。但其確切發病機制仍不確定。TLR4參與的信號傳導通路，在很多腫瘤及炎癥、病毒引起的病變中起著重要的作用，它是否參加了NASH的發生和發展，以及和肝星狀細胞的關系目前尚無研究。

3．1 肝星狀細胞在NASH中的表達及意義 肝星狀細胞位于肝竇周圍的間隙內，在生理情況下主要參與維生素A的代謝，可在多種細胞因子及活性氧自由基的作用下激活并轉化為肌成纖維樣細胞，表達α－SMA，活化后的星狀細胞產生大量以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質，并分泌轉化生長因子β（TGF－β）、血小板源性生長因子（PDFG）等各種促纖維化因子，來促進肝纖維化的進行。本研究得出α－SMA主要表達于活化的星狀細胞并和NASH炎癥和纖維化關系密切。證實了活化的星狀細胞促進NASH的發生及發展，是判定NASH的發展程度及預后的重要指標之一。

3．2 TLR4的生物學特性 1996年，霍夫曼實驗室在研究低等生物先天免疫機理的過程中等發現一種Toll分子基因突變造成果蠅對真菌的抵抗力完全喪失，提示Toll分子參與果蠅抵抗外界真菌感染的。進一步分析提出Toll因子是一種定位于細胞膜的跨膜蛋白，可感知病原體的存在并啟動機體防御的相關基因［1］。至今在動物中已經發現15種TLRs。TLRs屬于表面模式識別受體 （PRR），不同的TLRs因其胞外區氨基酸組成的差異決定了各自有其特異性的配體［2］。1998年布特勒實驗室發現了TLR4，并證實小鼠TLR4是LPS發揮生理功能的細胞膜受體，當TLR4結合LPS后可激活下游信號，從而引發炎癥反應［3］。

3．3 TLR4在NASH中的表達及意義 人類TLR4基因定位于9號染色體上的q32、q33．TLR4屬于泛生型，在體內廣泛分布于各類與免疫相關的細胞如中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞等，在肝臟主要存在于肝星狀細胞及枯否細胞［4］，最近的研究已經證實HSCs的激活與內毒素有關，LPS可能與其表面的TLR4結合而激活NF－κB和JNK信號通路，誘導了炎性及纖維化的相關細胞因子二促進肝臟纖維化形成［5］。Spruss等［6］的研究發現 NAFLD 患者往往攝入過多的果糖，從而使血漿甘油三酯水平升高，刺激腸道細菌大量生長并增加腸道通透性，使門靜脈中內毒素水平升高，激活KC和TLR4信號途徑產生和釋放大量炎癥相關因子和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）。

本研究中證實TLR 4蛋白表達于肝臟的部分星狀細胞及枯否細胞，和文獻報道一致。TLR 4在NASH組中的蛋白表達明顯高于正常組，且和NASH的炎癥分級和纖維化分期成正相關關系，和脂肪變性的程度無關。提示TLR 4參與的信號傳導途徑很有可能參與了NASH的形成，同時也促進了其炎癥和纖維化的進程。本試驗中TLR 4的蛋白表達和α－SMA成正相關關系。連續切片也提示TLR 4的蛋白與α－SMA陽性的活化的星狀細胞關系密切，推測TLR 4在NASH中的作用是通過促進星狀細胞的活化來進行的。

綜合我們的實驗結果表明TLR4在NASH疾病的發生發展中起了重要的作用，其在NASH中的作用很有可能是通過肝星狀細胞的活化來完成的。此研究不僅為探討NASH疾病的發生機制提供了新的方向，并為預防NASH的形成提供了一定的理論依據。

［1］Lemaitre B，Nicolas E，Michaut L，et al．The dorsoventral regulatory gene cassette sptzle／Toll／cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults［J］．Cell，1996，86（6）：973．

［2］Hayashi F，Smith K D，Ozinsky A，et al．The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll－like receptor 5［J］．Nature，2001，410（6832）：1099．

［3］Poltorak A，He X，Smirnova I，etal．1998．Defective LPS signaling in C3H／HeJ and C57BL／10ScCr mice：mutations in Tlr4gene［J］．Science，282（5396）：2085．

［4］Runping Gao，Jie Zhu，Xiujun Zhang，et al．Upregulation of tolllike receptor 4signaling pathway in human chronic pancreatitis［J］．The American Journal of Gastroenterology，2011，106（Suppl 2）：S64．

［5］王登妮，徐軍全，宋維芳，等．肝纖維化過程中Toll樣受體4在肝臟表達分布及意義［J］．中國比較醫學雜志，2010，6（20）：17．

［6］Spruss A，Kanuri G，Wagnerberger S，et al．Toll－like receptor 4 is involved in the development of fructose－induced hepatic steatosis in mice［J］．Chin J Clinicians（Electronic Edition）2009，50：1094．