c－Met蛋白、端粒酶在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

曹 揚(yáng)，張玫娜，郭志鵬，王廣義

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春130021）

原發(fā)性肝癌（primary liver carcinoma，PLC）是常見惡性腫瘤之一，我國主要高發(fā)于東南沿海地區(qū)。死亡率高，在我國惡性腫瘤中死因排第二位．肝癌死亡率呈升高態(tài)勢，但標(biāo)化死亡率已顯示升高幅度趨緩．肝癌防治應(yīng)當(dāng)繼續(xù)成為我國腫瘤防控的重點(diǎn)［1］。癌細(xì)胞的永生化是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特征，也是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。端粒酶（Telomerase）是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，目前大量的研究證明腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性與其細(xì)胞的無限增殖存在密切的關(guān)系。人端粒酶催化亞單位（human telomer－ase reverse transcriptasc hTERT）是端粒酶組成成分之一，且hTERT的表達(dá)與端粒酶的活性呈平行關(guān)系［2，3］。已知c－Met蛋白是肝細(xì)胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF）的單一受體，研究證明其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。然而目前尚未有研究表明肝細(xì)胞癌中端粒酶與c－Met蛋白的表達(dá)是否具有相關(guān)性，故本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對42例肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma HCC）和 10 例 癌 旁 細(xì) 胞 中 c－Met蛋 白 和hTERT基因蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)進(jìn)行檢測，分析二者在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義和相關(guān)性，進(jìn)而探討二者對肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的影響，為臨床肝細(xì)胞癌的診斷治療和預(yù)后判定提供理論依據(jù)

1 對象與方法

1．1 標(biāo)本

肝細(xì)胞癌標(biāo)本42例，為2007－2010年吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科存檔的肝細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本。其中男性：26例，女性16例；年齡30－79歲，平均60．8歲；有包膜：19例，無包膜23例；肝硬化：34例；乙肝表面抗原陽性（HBsAg）：36例；有肝內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移32例，無轉(zhuǎn)移10人。另取10例肝細(xì)胞癌癌旁組織標(biāo)本作為對照組。

1．2 主要試劑

兔抗人TERT端粒酶（bs－0233R）多克隆抗體及兔抗人c－met／HGFR（bs－0668R）多克隆抗體，免疫組化染色試劑盒（SP－0023）和DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

嚴(yán)格按S－P免疫組化染色檢測試劑盒所附操作程序進(jìn)行操作。

1．4 結(jié)果判斷

c－Met蛋白以胞漿和胞膜染成黃色或棕黃色；hTERT以細(xì)胞核和／或細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。每張切片與高倍鏡（10×20）隨機(jī)取5個視野，分別觀察兩者陽性強(qiáng)度和陽性率。先按染色強(qiáng)度（a）如下評分：無色為0分；淺黃為1分；黃為2分；棕黃為3分。然后再按陽性細(xì)胞所占百分比b（%）評分：陽性細(xì)胞＜5%為0分；陽性細(xì)胞5%－25%為1分；陽性細(xì)胞26%－50%為2分；陽性細(xì)胞51%－75%為3分；陽性細(xì)胞＞75%為4分。結(jié)果分析：a×b在0分計(jì)（－）；0－2分計(jì)為（＋）；2－6分計(jì)為（＋＋）；6－12分計(jì)為（＋＋＋）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

陽性率組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級分組資料組間比較采用非參秩和檢驗(yàn)分析，相關(guān)分析用非參數(shù)相關(guān)（Spearman）分析，采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)

c－Met蛋白和hTERT在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)陽性率分別為76．19%和88．09%，對照組分別為30%和40%。兩組間陽性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1，圖1。

表1 c－Met、hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)比較

2．2 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

行Sperman相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)為r＝0．140，兩者之間無相關(guān)性（P＞0．05），見表2。

表2 c－Met、hTERT在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)的相關(guān)性

2．3 c－Met蛋白和hTERT的表達(dá)與肝細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

c－Met的表達(dá)與性別、年齡、肝硬化及 HBsAg無關(guān)（P＞0．05），與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0．05）；hTERT與性別、年齡、腫瘤的轉(zhuǎn)移及HBsAg均無關(guān)（P＞0．05），與肝硬化有關(guān)（P＜0．05），見表3。

表3 c－Met和hTERT的表達(dá)與肝細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

2．4 c－Met在hTERT陽性和陰性的肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)

hTERT陽性肝細(xì)胞癌組織中c－Met（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）和（－）分別為15、9、5和8例。hTERT陰性肝細(xì)胞癌組織中c－Met（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）和（－）分別為0、2、1和2例。兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），見表4。

2．4 c－Met在hTERT陽性和陰性的肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)

圖1 c－Met和hTERT在肝細(xì)胞癌和癌旁組織中表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞有別于正常組織細(xì)胞其一在于細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程主要包括：腫瘤細(xì)胞自身的黏附性降低、瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用即基質(zhì)溶解和移動、瘤細(xì)胞從原位點(diǎn)沿著缺損的ECM向周圍侵襲或進(jìn)入淋巴管、血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［4］。研究認(rèn)為 HGF／c－Met蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使β2連環(huán)蛋白的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，使之不能與E2鈣粘蛋白胞內(nèi)部分結(jié)合形成復(fù)合體，阻礙了E2鈣粘蛋白和細(xì)胞骨架的連接作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞之間的粘附作用減弱。基質(zhì)金屬蛋白酶－9（Matrix metalloproteinases－9，MMP－9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要一員，又稱明膠酶B，大量的能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，Abounader R等［5］研究認(rèn)為 HGF／c－Met蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可誘導(dǎo)MMP－9的生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示c－Met蛋白的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。Maulik G 等研究也認(rèn)為HGF與其受體c－Met結(jié)合并啟動該受體酪氨酸激酶的活性，進(jìn)而啟動ECM的降解最終參與腫瘤細(xì)胞的浸潤［6］。

研究認(rèn)為腫瘤血管形成是惡性腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，當(dāng)腫瘤組織生長到直徑大于1－2mm時，其進(jìn)一步生長需要新生血管為其提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤血管形成是一個復(fù)雜的多因素過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)HGF可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有誘導(dǎo)血管生成的作用；并且可以通過自分泌和旁分泌的形式與c－Met相結(jié)合直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞或影響其他血管生長因子（如VEGF、bFGF）的表達(dá)和分泌，間接促進(jìn)血管的生長。還有研究認(rèn)為受到 HGF活化的c－Met蛋白受體動員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、形成血管樣結(jié)構(gòu)［7，8］。

腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常組織細(xì)胞其二在于細(xì)胞的無限增殖永生能力。大量研究表明，細(xì)胞獲得永生能力與端粒酶的激活密切相關(guān)，由于端粒酶的激活，使端粒的長度維持一種動態(tài)平衡，使腫瘤細(xì)胞獲得無限制增殖的能力。端粒酶活化是腫瘤發(fā)生的一個顯著的生物學(xué)特征［9］。端粒酶主要由兩部分組成：模板RNA和hTERT，后者以前者起逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，后者與細(xì)胞端粒酶活性高低密切相關(guān)，hTERT的變化可較準(zhǔn)確的反映細(xì)胞中端粒酶活性的變化［10］。本實(shí)驗(yàn)hTERT在肝細(xì)胞癌組織和癌旁中的表達(dá)陽性率分別為88．09%和40%。兩組間陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示c－Met蛋白與端粒酶的表達(dá)無相關(guān)性r＝0．140（P＞0．05），但端粒酶陽性的肝細(xì)胞癌中c－Met蛋白的表達(dá)量要明顯的多于端粒酶陰性的肝細(xì)胞癌組織（P＞0．05）。此結(jié)果側(cè)面的反應(yīng)了端粒酶陽性的肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力要明顯的強(qiáng)于端粒酶陰性的肝細(xì)胞癌組織。因此對二者定量的檢測可能給臨床的治療及預(yù)后帶來一定的指導(dǎo)意義。

［1］Chen JG，Zhang SW，Chen WQ，et al．Analysis of liver cancer mortality in the national retrospective sampling survey of death causes in China，2004－2005［J］．Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi．，2010，44（5）：383．

［2］Middleman EJ，Choi J，Venteicher AS，et al．Regulation of cellular immortalization and steady－state levels of the telomerase reverse transcriptase through its carboxy－terminal domain［J］．Mol Cell Biol，2006，26（6）：2146．

［3］Sabah M，Cummins R，Leader M，et al．Immunohistochemical detection of hTERT protein in soft tissue sarcomas：correlation with tumor grade［J］．Appl Immunohistochem Mol Morphol，2006，14（2）：198．

［4］Pantel K，Brakenhoff RH．Dissecting the metastatic cascade［J］．Nat Rev Cancer，2004，4（6）：448．

［5］Abounader R，Ranganathan S，Lal B，et al．Reversion of humanglioblastoma malignancy by U1small nuclear RNA／ribozyme targeting of scatter factor／HGF and c－met expression［J］．J Natl Cancer Inst，1999，91（18）：1548．

［6］Maulik G，Shrikhande A，Kijima T，et al．Role of the hepatocyte growth factor receptor，c－Met，in oncogenesis and potential for therapeutic in－h(huán)ibition［J］．Cytokine Growth Factor Rev，2002，13（1）：41．

［7］Kim E S，Sal g i a R．MET pat hw ay as a therapeu tic target［J］．J Thorac On col，2009，4（4）：444．

［8］SattlerM，Sa l giaR．TheMET ax is as at herapeu tic target［J］．Update Cacer Ther，2009，3 （3）：109．

［9］龍 軍，付曲波，黃才斌，等．端粒、端粒酶及其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控與腫瘤［J］．贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28（3）：467．

［10］Hu J，Banerjee A，Goss DJ．Assembly of b／HLH／z proteins c－Myc，Max，and Mad1wit h cognate DNA：importance of proteinprotein and protein－DNA interactions［J］．Biochemistry，2005，44（35）：11855．