吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群醛固酮合酶基因（CYP11B2）－344T／C多態性分布的研究

劉 行，隋明醒，王立平，湯 贏，全成實＊

（1．吉林大學病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2．吉林大學白求恩醫學院 臨床醫學2009級）

醛 固 酮 合 成 酶 （aldosterone synthase，CYP11B2）基因屬于線粒體細胞色素P450酶超家族，是調節血壓的一個重要基因［1］。CYP11B2基因主要有兩種常見的變異，一種變異為CYP11B2基因的第2個內含子中大部分堿基被CYP11B1基因的序列所取代；另一種變異位于啟動子區域－344位點處，該處是類固醇生成轉錄因子1（SF－1）的結合位點，該位點可發生C與T的交換［2］。研究表明，不同種族之間CYP11B2基因多態性的分布可能存在差異，而這種差異可能通過影響醛固酮的生成參與高血壓及動脈粥樣硬化等心血管疾病的進程［3］。因此，本研究檢測和分析吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群CYP11B2基因－344T／C位點的多態性分布，為原發性高血壓等心血管疾病的前瞻性研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 研究對象

詢問病史主要排除高血壓病，糖尿病，心腦血管疾病和腫瘤等目前被證實與遺傳有關的疾病。選取吉林省地區健康人群共126人，其中朝鮮族67人（男性33人，女性34人），漢族59人（男性28人，女性31人）。年齡35歲－79歲，平均年齡為55歲。受檢者采外周靜脈血2ml，－20℃保存備用。

1．2 基因組DNA提取

用淋巴細胞提取液（北京鼎國公司）從保存的血樣中分離淋巴細胞，具體操作按說明書進行，常規方法提取基因組DNA。

1．3 PCR擴增CYP11B2基因的特異性片段

根據文獻［4］設計引物，序列如下：P1：5＇－CAGGAGGAGACCCCATGTGAC－3＇，P2：5＇－CCTCCACCCTGTTCAGCCC－3＇。引物由上海生工合成，PCR產物片段為538bp。用TAKARA公司PCR試劑盒進行PCR反應。反應體系為20μl，其中上下游引物各位1．0mol·L－1，DNA模板為100ng，Tag DNA聚合酶混合物10μl。在PCR儀（PTC－100，MJ research．公司）上進行以下循環：94℃預變性5min，94℃變性50s，62℃退火50s，72℃延伸50s，共35個循環，最后72℃延伸10min。

1．4 酶切反應及電泳

酶切反應體系為20μl，其中PCR產物7μl，HaeⅢ內切酶（TAKARA公司）1μl，10×M buffer 2μl，滅菌水10μl，37℃水浴孵育30min。取酶切產物5μl于2．5%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外照射儀下觀察結果。

1．5 CYP11B2基因多態性判定

PCR產物經HaeⅢ內切酶酶切后可觀察到3種帶型。具有273bp和137bp條帶為純合子TT基因型：203bp和137bp條帶為純合子TT基因型；同時含有273bp、203bp和137bp條帶為雜合子TC基因型。

1．6 統計學處理

采用SPSS12．0進行數據統計分析。應用擬合優度χ2檢驗方法計算SNPs的基因頻率分布是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。兩組之間的基因型頻率以及等位基因頻率分布的差異采用χ2檢驗。

2 結果

2．1 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗

經擬合優度χ2檢驗，CYP11B2基因型頻率在朝鮮族和漢族健康人群組的分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，P＞0．05，表明樣本具有群體代表性。

2．2 CYP11B2基因多態性和等位基因分布比較

CYP11B2基因PCR擴增產物為538bp，見圖1。PCR產物經HaeⅢ內切酶酶切后可觀察到3種帶型。具有203bp和137bp條帶為純合子CC基因型；273bp和137bp條帶為純合子TT基因型；同時含有273bp，203bp和137bp條帶的為雜合子TC基因型，見圖2。

67名朝鮮族中CC、TC和TT基因型頻率分別為9%（6／67）、22%（15／67）和69%（46／67）；59名漢族中CC、TC和TT基因型頻率分別為19%（11／59）、27%（16／59）和54%（32／59），兩者差異無顯著性（χ2＝3．522；P＝0．172），見表1。

朝鮮族人群中C和T等位基因頻率分別為20%和80%；漢族人群中分別為32%和68%，兩者差異具有顯著性（χ2＝4．763；P＝0．029），見表1。

圖1 CYP11B2基因PCR產物電泳圖

圖2 酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 朝鮮族和漢族CYP11B2基因型和等位基因頻率分布（%）

3 討論

醛固酮合成酶（aldosterone synthase，CYP11B2）基因是醛固酮體內生物合成的關鍵基因，位于8號染色體長臂遠端，含有9個外顯子和8個內含子［5］。CYP11B2基因轉錄調控區和第2內含子區域有兩個位點存在基因多態性現象，即－344T／C和－470T／C，其中－344T／C位點的基因多態性與原發性高血壓病的關系引起人們的關注［6］。CYP11B2基因具有合成醛固酮的作用，通過調節水鈉代謝影響血壓。因此，CYP11B2基因已被確認為是原發性高血壓的主要候選基因之一。

有研究表明，延邊地區朝鮮族成人高血壓患病率明顯高于當地漢族［7］。有關膳食結構、生活習慣及環境因素與朝鮮族和漢族成人高血壓患病率的關系已有研究報道［8］，但有關吉林省地區朝鮮族和漢族人群的高血壓患病率與相關基因易感性的研究尚未見報道。CYP11B2基因多態性及等位基因分布頻率存在種族差異，這種差異對原發性高血壓等心血管疾病具有一定的預測價值。本研究檢測和分析了吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群CYP11B2基因－344T／C多態性及其分布特征。結果顯示，67名朝鮮族人群中CC、TC和TT基因型分別為6例、15例和46例；59名漢族人群中CC、TC和TT基因型分別為11例、16例和32例，兩者差異無顯著性。結果提示，朝鮮族和漢族原發性高血壓的易感性可能與CYP11B2基因－344T／C多態性沒有明顯的關系，朝鮮族心腦血管疾病的死亡率明顯高于當地漢族，可能與飲食和環境等生活方式有關。本實驗結果同時顯示，朝鮮族C和T等位基因頻率分別為20%和80%；漢族分別為32%和68%，兩者差異具有顯著性。中國吉林省地區朝鮮族健康人群CYP11B2基因－344T／C多態性C等位基因頻率低于當地漢 族，明 顯 低 于 日 本［9］（35．9%）、法 國［10］（46%）及芬蘭［11］（52．6%），進一步提示 CYP11B2基因C和T等位基因分布具有種族差異。

本研究初步研究中國吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群CYP11B2基因－344T／C多態性分布的特點。由于人群分布的局限性及樣本量少，不一定能夠代表中國朝鮮族和漢族人群CYP11B2基因－344T／C多態性的分布狀況，有待于進一步在中國多個地區擴大樣本量。在不常人群中獲得基因多態性分布的相關資料，將有助于對相關疾病進行遺傳學及前瞻性研究。

［1］Curnow KM，Tusie－Luna MT，Pascoe L，et al．The product of the CYP11B2gene is required for aldosterone biosynthesis in the human adrenal cortex［J］．Journal of Molecular Endocrinology．1991，5（10）：1513．

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［3］宋瑞琦，姬苓．醛固酮合酶基因多態性與心腦血管疾病和血漿醛固酮水平關系的研究進展［J］．西部醫學．2011，23（3）：589．

［4］Rajan S，Ramu P，Umamaheswaran G，Adithan C．Association of aldosterone synthase（CYP11B2C－344T）gene polymorphism ＆susceptibility to essential hypertension in a south Indian Tamil population［J］．Indian J Med Res，2009，132：379．

［5］Tamaki S，Iwai N，Tsujita Y，et al．Genetic polymorphism of CYP11B2gene and hypertension in Japanese［J］．Hypertension，1999，33：266．

［6］Koizumi J，Mabuchi H，yoshimura A，et al．Deficiency of serum cholesteryl－ester transfer activity in patients with familial hyper alpha lipoprotein nemia［J］．Athroselerosis，1985，58：175．

［7］吳善玉，方今女，全貞玉，等．延吉市朝鮮族和漢族居民死亡水平分析［J］．延邊大學醫學學報，2004，21（1）：46．

［8］崔 蘭，方 哲，方今女，等．朝鮮族和漢族中老年人群血壓分布特點［J］．中國老年學雜志，2009，20：2574．

［9］Matsubara M，Kikuya M，Ohkubo T，et al．Aldosterone synthase gene（CYP11B2）C－334Tpolymorphism，ambulatory blood pressure and nocturnal decline in blood pressure in the general Japanese population：the Ohasama study［J］．J Hypertens，2001，19（12）：2179．

［10］Tiret L，Mallet C，Poirier O，et al．Lack of association between polymorphisms of eight candidate genes and idiopathic dilated cardiomyopathy：the CARDIGENE study［J］．J Am Coll Cardiol，2000，35（1）：29．

［11］Ylitalo A，Airaksinen KE，Hautanen A，et al．Baroreflex sensitivity and variants of the renin angiotensin system genes［J］．J Am Coll Cardiol，2000，35（1）：194．