MSCs對輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤中T細胞CD4／CD8各亞群及各亞群中CD45比例變化的影響

王 玲，張紅梅，李東紅，宋新靈，國春龍，陳玉丙，盧日峰＊

（1．吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 長春130021；2．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院唐敖慶特聘教授實驗室；3．吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科；4．吉林省申邦生物技術(shù)有限公司）

本課題組曾進行骨髓間充質(zhì)干細胞多方面的研究，首先研究了MSCs可以降低輻射誘導(dǎo)胸腺瘤的發(fā)生率［2］，進而從細胞水平研究了MSCs對輻射誘導(dǎo)胸腺組織具有損傷修復(fù)作用［3］，接下來我們應(yīng)用流式細胞術(shù)從分子水平研究MSCs對輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤中T細胞CD4／CD8各亞群及各亞群中CD45比例變化的影響，從而說明MSCs對輻射誘導(dǎo)的胸腺瘤T細胞亞群的修復(fù)作用，提示MSCs對胸腺瘤具有治療作用。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 試 劑 和 主 要 儀 器 anti－CD4－PECy5，anti－CD8－PE，anti－CD45－FITC，同型對照抗體Fluorescein isothiocyanate （FITC）Rat IgG2bIsotype Control、IgG2bIsotype Control、Rat IgG2bK Isotype Control PE－Cy5（eBioscience公司）；L－DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶（GIBCO 公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；CO2培養(yǎng)箱（Sigma公司）；FACSCalibur（美國BD公司）；飛利浦深部X線放射治療機（美國）。

1．1．2 動物：健康C57BL／6小鼠，體重16±2g，雌性，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

1．2 方法

1．2．1 MSCs細胞的培養(yǎng)［4］取 C57BL／6乳鼠，脫臼處死，75%酒精浸泡片刻。無菌條件下分離股骨、肱骨，剪去干骺端，用L－DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液，200目濾網(wǎng)過濾后，1 000r／min離心5min，棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，以2．0×105個／ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后棄懸浮細胞。72 h后，第1次換液，以后每3d更換培養(yǎng)液，當(dāng)細胞接近90%融合時，用0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化2min，按1∶2的比例傳代。待傳至3代時，收集MSCs細胞，計數(shù)。

1．2．2 應(yīng)用經(jīng)典kaplan方法建立動物模型 將C57BL／6小鼠隨機分為3組，即正常組、單純照射組、MSCs治療組，每組8只。應(yīng)用飛利浦深部X線放射治療機參考經(jīng)典Kaplan法［3］對單純照射組和MSCs治療組鼠進行1．75Gy全身照射，劑量率0．287Gy／min，每周一次，共4次。末次照射后第二天，治療組小鼠按照2×106個MSCs細胞／ml，0．2 ml／只經(jīng)尾靜脈注射。計時，6個月后，將鼠處死，取胸腺組織作流式。

1．2．3 流式細胞術(shù)分析胸腺細胞CD4、CD8和CD45的表達［5］無菌取小鼠胸腺，研磨制成勻漿，經(jīng)400目濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，1 500rpm離心5 min，棄去上清，加入5ml紅細胞裂解液懸浮細胞，室溫放置5min。1 500rpm離心5min，棄去上清，PBS洗滌2次，計數(shù)，以2×105～1×106個細胞／100μl，分 別 加 入 anti－CD4－PECy5，anti－CD8－PE，anti－CD45－FITC，并設(shè)同型抗體對照。室溫避光孵育30min。PBS洗滌2次，流式細胞儀FACSCalibur采集信息，CellQeust Pro軟件分析數(shù)據(jù)。

1．3 統(tǒng)計分析 計量資料采用SPSS17．0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示。多組間比較用方差分析，顯著性水準α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 流式細胞術(shù)分析胸腺細胞中CD4CD8各亞群的表達

正常組、輻射組、MSCs治療組3組小鼠在6個月后處死，取胸腺，做成單細胞懸液做流式。流式細胞術(shù)分析結(jié)如圖1所示，表明照射之后CD4＋CD8＋顯著增加，MSCs治療后有向成熟T細胞CD4＋CD8－和CD4－CD8＋發(fā)展的趨勢。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示：照射后CD4－CD8－亞群比例由正常組的（5．11±5．10）%降低到（0．01±0．01）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），MSCs治療（0．61±0．39）%后有所恢復(fù)；MSCs治療組（91．49±4．47）%中 CD4＋CD8＋亞群比例與正常組（82．44±6．06）%接近，單純照射組（99．09±0．49）%顯著高于正常組（P＜0．05）；照射后CD4＋CD8－亞群由（7．72±3．37）%下降到（0．87±0．49）%，CD4－CD8＋亞群由（4．74±2．59）%下降到（0．02±0．01）%，MSCs治療后 CD4＋CD8－和CD4－CD8＋都有不同程度上調(diào)，見表1。提示MSCs具有修復(fù)輻射造成的胸腺損傷的功能。

表1 不同組別中小鼠胸腺細胞CD4CD8各亞群占CD4CD8胸腺細胞的百分率（ˉx±s）

圖1 流式細胞術(shù)分析輻射誘導(dǎo)C57BL／6小鼠胸腺瘤模型胸腺T細胞亞群

2．2 流式細胞術(shù)分析胸腺細胞CD4CD8中CD45＋的表達

流式細胞術(shù)分析結(jié)果如圖2所示，表明治療組CD45＋在CD4＋CD8＋中的比例與正常組接近，而輻射組與正常組差別較大。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示：正常組、單純照射組、MSCs治療組中CD45＋在CD4＋CD8＋中 的 比 例 分 別 為 （86．09±2．24）%、（0．16±0．03）%、（97．35±3．23）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。單 純 照 射 組 中CD4－CD8－、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中CD45＋有不同程度的降低，MSCs治療組有不同程度升高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，如表2所示。

表2 各組小鼠胸腺細胞中CD45＋在CD4CD8細胞中的百分率（ˉx±s）

圖2 不同組別中CD45＋在胸腺細胞CD4＋CD8＋中的表達

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在再生醫(yī)學(xué)中眾所周知，且被廣泛使用，因為它不僅對傷口的愈合有效，而且可以促進皮膚再生。此外，據(jù)報道，干細胞移植還可以降低炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)血管生成［6］。許多研究已證實，當(dāng)皮膚或其它部位損傷之后，MSCs遷移到損傷部位。Badiavas等發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射GFP標記的MSCs在沒有GFP的小鼠皮膚中被發(fā)現(xiàn)。這表明損傷刺激MSCs遷移到損傷部位，也可以分化為有功能的皮膚細胞。這是由于炎性細胞因子引導(dǎo)了傷口的位置并產(chǎn)生趨化遷移，從而引起MSCs移向傷口部位。

胸腺是機體的造血器官，能產(chǎn)生淋巴細胞，并將其運送到淋巴結(jié)和脾臟等處。這種淋巴細胞對機體的細胞免疫具有重要作用。胸腺是T細胞發(fā)育分化成熟的場所，是重要的中樞免疫器官。胸腺細胞是機體細胞免疫功能的基礎(chǔ)，同時，胸腺細胞受體（CD分子）的表達是胸腺細胞信息傳遞系統(tǒng)的重要環(huán)節(jié)。胸腺細胞按照CD4、CD8標志區(qū)分可分為CD4－CD8－、CD4＋CD8＋、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－4個亞組，它們分別代表胸腺細胞成熟分化的不同階段。早期的胸腺細胞前體CD4－CD8－雙陰性細胞不足胸腺細胞總數(shù)的3%，隨后發(fā)育為普通胸腺細胞CD4＋CD8＋雙陽性細胞，并受到嚴格的陽性選擇。經(jīng)過陽性選擇后的T細胞還必須經(jīng)過陰性選擇過程，才能成為具有識別外來抗原的成熟的T細胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－。研究資料表明：由于在胸腺細胞各亞組中CD4－CD8－細胞對輻射最為敏感，因此，X射線全身照射小鼠后，，使在正常情況下占胸腺細胞4．81%的CD4－CD8－細胞迅速下降到0．01%。成熟的T淋巴細胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－經(jīng)照射后迅速下調(diào)，轉(zhuǎn)化為普通胸腺細胞CD4＋CD8＋，MSCs治療后有向成熟細胞CD4－CD8＋和CD4＋CD8－分化的趨勢。

CD45分子為I型跨膜蛋白，通過激活蛋白酪氨酸磷酸酶調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)，維持T淋巴細胞正?；罨?。其幾乎表達于所有有核白細胞，在同一細胞系的不同發(fā)育階段，細胞越幼稚、分化越低、則CD45表達越少［7］。Ulyanova 等［8］研 究 顯 示，缺 乏 CD45 的CD4＋、CD8＋T細胞，其抗原特異增殖能力、分泌干擾素（IFN－γ）能力以及溶解靶細胞能力均降低。本研究顯示，MSCs通過尾靜脈輸注到輻射誘導(dǎo)的C57BL／6小鼠胸腺瘤模型體內(nèi)，模型組CD45＋在CD4－CD8－、CD4＋CD8＋、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中的百分率均低于正常對照組，而治療組CD45＋在CD4＋CD8＋、CD4－CD8－、CD4－CD8＋和CD4＋CD8－中的百分率均高于輻射組，提示MSCs可使CD45＋表達增高，從而活化了T細胞，對輻射損傷的胸腺瘤起修復(fù)作用。

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