鮑曼不動桿菌的耐藥性及β－內酰胺酶耐藥基因的研究

鄧麗華，施德仕，楊榮勝，許美榮，胡莉萍

（徐州醫學院附屬醫院 檢驗科，江蘇 徐州221002）

鮑曼不動桿菌是臨床常見的致病菌之一，其耐藥率高，耐藥機制復雜，給臨床治療帶來很大困難，被冠名為革蘭陰性桿菌的MRSA［1］，特別是產β－內酰胺酶菌株常造成感染的流行與暴發，甚至出現多重耐藥，這已成為一個全球性問題［2－5］。為了解我院鮑曼不動桿菌耐藥性及β－內酰胺酶基因流行特點，我們檢測了臨床分離的50株鮑曼不動桿菌，并用分子生物學技術檢測了5種較常見的β－內酰胺酶相關基因 TEM－1、IMP、0XA－23、0XA－24、AmpC，以期發現本地區的產β－內酰胺酶鮑曼不動桿菌的特點，現報告如下。

1 材料與方法

1．1 主要儀器和試劑 美國BD公司Phoenix－100型全自動細菌鑒定藥敏分析系統，PCR擴增儀ABI2720為美國ABI公司產品，DYY一8C型電泳儀為北京市六一儀器廠產品，ZF－20D暗箱式紫外分析儀購自鞏義市予花儀器公司，PCR MasterMix試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1．2 菌株來源 2011年1月至2011年11月徐州醫學院附屬醫院住院患者痰、中段尿、腦脊液、血液等不重復標本中分離的50株鮑曼不動桿菌。

1．3 藥物敏感試驗 采用最低抑菌濃度（MIC）法，全部菌株均使用美國BD公司Phoenix－100全自動細菌鑒定藥敏分析系統檢測，結果判定按美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2010年版標準執行。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛生部臨床檢驗中心。

1．4 鮑曼不動桿菌DNA的制備 將經過Phoenix－100型全自動細菌鑒定藥敏分析系統鑒定后儲存于－70℃低溫冰箱的50株鮑曼不動桿菌轉入血平板，經18－24h培養后，挑取3－4個菌落轉入到1ml生理鹽水中，離心半徑6㎝，10 000r／min離心1min，在細菌沉淀中加入0．16ml無菌去離子水，充分震蕩混勻，然后100℃水浴10min，再在冰盒里冰浴10 min，離心半徑6㎝，10 000r／min離心1min后取上清液作為作為DNA模板，－20℃冰箱保存備用。

1．5 隨機引物PCR擴增分型 參考文獻［6］的實驗結 果，選 用 隨 機 引 物 ERIC1R（5’－ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC－3’） 和 ERIC2 （5’－AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG －3’）．進 行PCR反應擴增。后將PCR產物在1．5%的瓊脂糖凝膠中，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布并對其基因型進行分析。

1．6 擴增引物 TEM－1、0XA－23、0XA－24、IMP、AmpC型基因擴增引物的設計和基本方法參照文獻［7］，由上海生工生物工程有限公司合成，各種靶基因引物序列和目的產物長度見表1。

表1 PCR引物序列

1．7 基因檢測 均為PCR法檢測。共檢測5種β－內酰 胺 酶 基 因，包 括 TEM－1、0XA－23、0XA－24、IMP、AmpC，各種靶基因PCR擴增體系體積20μl，其中2×Taq PCR Master Mix 10μl，10μmol／L的上、下游引物各 μl，滅菌ddH2O 7μl，DNA 模板1 μl。離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應。TEM、IMP反應條件：94℃預變性5min。94℃60 s，55℃ 60s，72℃ 50s。0XA－23、0XA－24反應條件：94℃預變性5min，94℃30s，48℃30s，720C35 s。AmpC反應條件：94℃預變性5min。94℃30s，50℃30s，72℃50s。以上反應經30次循環后，72℃延伸7min。以DNA MarkerI和D2000為相對分子質量標準。取5μl擴增產物點樣于含核酸染料的1．5%瓊脂糖凝膠，150V電泳20min后紫外凝膠電泳成像儀下觀察結果并照相。

1．8 耐藥基因序列分析 取PCR產物送上海生工生物工程有限公司，由上海生工生物工程有限公司協助完成。

2 結果

2．1 藥敏試驗結果 50株鮑曼不動桿菌對多粘菌素B全部敏感，而對其余18種抗生素耐藥率為52%－100%，除多粘菌素B外全部耐藥的24株，主要來自于ICU，標本類型主要為痰標本，50株鮑曼不動桿菌對臨床常用β－內酰胺類抗生素有較高的耐藥率，對第三、四代頭孢菌素的頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟的耐藥率均達80%以上，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率也達62%以上，對除多粘菌素B外目前常用的抗生素耐藥率達52%以上。50株鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥性見表2。

2．2 50株鮑曼不動桿菌分型結果 50株鮑曼不動桿菌分成8個基因型，其中B型34株，G型4株，F、H型各2株，其余均各為1株，B型菌株為主要的流行株，其余均為散發菌株。34株B型中，有22株來自ICU，7株來自腦外科，3株來自普外科，2株來自呼吸內科，34株菌有26株為多重耐藥的鮑曼不動桿菌，且均攜帶3種及以上β－內酰胺酶基因?；蚍中鸵妶D1。

表2 50株鮑曼不動桿菌藥物敏感試驗結果

圖1 鮑曼不動桿菌基因分型

2．3 β－內酰胺酶基因檢測結果 50株鮑曼不動桿菌β－內酰胺酶的基因型分布為 TEM－1陽性率100%（50／50），AmpC陽性率92%（46／50），0XA－24陽性率62%（31／50），0XA－23陽性率42%（21／50），IMP陽性率14%（7／50）。隨機選擇10株鮑曼不動桿菌PCR產物進行測序，其結果在國際互聯網上進行BLAST檢索分析，基因測序結果與GenBank序列完全一致，同源性符合率為99～100%。PCR基因擴增結果見圖2。

2．4 藥敏結果與β－內酰胺酶基因型分布比較 本組細菌多數對頭孢類抗生素及β－內酰胺類復合制劑耐藥，其耐藥基因有多種基因組合方式，以TEM－1＋ AmpC＋0XA－24陽性為最常見，共29株，占58%，該組細菌對第三、四代頭孢類抗生素、β－內酰胺類復合制劑及碳青酶烯類抗生素部分耐藥，有12株的基因組合為 TEM－1＋ AmpC ＋0XA－24＋0XA－23陽性，占24%，該組細菌對頭孢類抗生素、β－內酰胺類復合制劑及碳青酶烯類抗生素均耐藥，只有2株菌同時攜帶5種耐藥基因，這2株菌除粘菌素B外全部耐藥。

圖2 β－內酰胺酶基因PCR基因擴增圖譜

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫院感染中較為常見的病原菌之一，它可引起多種醫院感染，包括呼吸道感染、敗血癥、外傷創面感染、腦膜炎、尿路感染和呼吸機相關性肺炎等，由鮑曼不動桿菌感染導致的病死率呈上升趨勢，主要是因為鮑曼不動桿菌常常是多重耐藥，甚至泛耐藥，給治療帶來極大困難。我們從收集的50株鮑曼不動桿菌臨床資料上看，主要來源于ICU，標本種類為痰，說明我院的鮑曼不動桿菌主要引起呼吸系統感染。其在ICU分離率較高，這可能與ICU的病人大多有嚴重的基礎疾病，住院時間較長，免疫力低且長期大量使用廣譜抗生素和接受各種插管及呼吸機輔助治療，發生感染的機會增加。ICU發生院內感染率為其它科室的5－10倍，感染耐藥菌的機會高2－3倍［8］。本研究結果顯示，50株鮑曼不動桿菌對頭孢菌素類抗生素高度耐藥，對哌拉西林／他唑巴坦、亞胺培南、美洛培南等也有較高耐藥率，均達60%以上。有文獻報道［9］，目前治療耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌感染可選抗生素極為有限，國外經驗用舒巴坦或氨芐西林／舒巴坦、頭孢哌酮／舒巴坦及莫西沙星治療，由于BD公司Phoenix－100型全自動細菌鑒定藥敏分析系統沒有頭孢哌酮／舒巴坦藥物，此50株鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮／舒巴坦耐藥率是否與我們的氨芐西林／舒巴坦相當，我們將對此作進一步研究。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制非常復雜，其中以產生β－內酰胺酶為主要機制。細菌產生β－內酰胺酶，破壞抗菌藥物β－內酰胺環，使抗菌藥物失去活性從而對不同類的β－內酰胺類和碳青霉烯類藥物耐藥。β－內酰胺酶包括超廣譜β－內酰胺酶（TEM－1）、頭孢菌素酶（AmpC）、金屬酶（IMP）和D類OXA碳青霉烯酶（0XA－24、0XA－23）。從本研究結果來看，鮑曼不動桿菌不僅具有多重耐藥性，而且IEM－1、0XA－24、AmpC等β－內酰胺酶基因攜帶率高，50株鮑曼不動桿菌均檢出β－內酰胺酶基因，并且同一菌株攜帶多種耐藥基因可能是導致本地區鮑曼不動桿菌對β－內酰胺類及碳青霉烯類抗生素耐藥率高的重要原因之一。

本研究顯示存在菌株克隆傳播，占分析菌株總數最多的B型共34株，分布于ICU、腦外科，普外科，呼吸內科，該菌株為主要的流行株，且分離于不同時間，不同患者，本院是一所大型綜合性教學醫院，見習生、實習生、進修生等輪轉科室的醫護人員，或轉科治療的患者等流動人員均有傳播病原菌的可能。

值得一提的是，此次研究的50株鮑氏不動桿菌中有24株是“全耐株”鮑曼不動桿菌，即“泛耐藥株”，泛耐藥株指除多粘菌素B外，對臨床常用抗菌藥物全部耐藥的菌株，幾乎無藥可治［10］。需注意跟蹤監測，如何控制這些泛耐藥菌株的產生與擴散，必將成為新的重大課。盡管試驗顯示多粘菌素B有良好的體外抗菌活性，但是多粘菌素B具有較大的腎毒性和神經毒性，多重或泛耐藥鮑曼不動桿菌感染促使多粘菌素B已可能作為治療的最后藥物選擇，令人擔憂的是耐多粘菌素B鮑曼不動桿菌流行克隆株或新耐藥株已有報道［11］。為防止和抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌株的增加，臨床上應加強對該類菌株的耐藥性監測，治療由多重耐藥鮑曼不動桿菌引起的感染時，應高度重視與微生物室保持聯系和溝通，根據藥敏結果有針對性地選擇抗菌藥物，減少盲目用藥，并應加強消毒隔離管理制度，防止耐藥菌株的傳播與流行，保護抗生素資源，做到合理用藥，提高治療疾病的水平。并且同時應加強抗菌藥物的監管，因此衛生部制定的《抗菌藥物臨床應用指導原則》是很有必要的，它對抗生素的合理應用及控制耐藥株的產生定會起到重要的作用。

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