胰島素樣生長因子1對于實驗性動脈粥樣硬化斑塊細胞組織結構的影響

劉 洋，許金鵬，劉福林

（1．保定市第二醫院 心外科，河北 保定071000；2．河北大學附屬醫院心臟科，河北 保定071000）

動脈粥樣硬化是造成心腦血管疾病的根本原因。臨床工作中，大量發生急性心血管事件的患者提前沒有任何可供預警的癥狀體征。研究認為，急性心血管事件的發生絕大多數是由于動脈粥樣硬化斑塊破裂誘發血栓形成造成的，在急性冠脈綜合征的發生原因中，斑塊破裂約占60%－75%，斑塊潰瘍約占25%－40%，鈣化小結約占2%－7%［1，2］，這種易于破裂的斑塊稱為“易損斑塊”。

胰島素樣生長因子1（Insulin－like growth factor 1，IGF－1）是一種受生長激素調節，與胰島素原有高度同源性的單鏈多肽類生長因子。動脈粥樣硬化形成過程中涉及的炎癥細胞、血管平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）、巨噬細胞和血管內皮細胞均可分泌IGF－1。IGF－1能夠改變細胞周期進程，抑制血管SMC凋亡，誘導SMC增殖，從而穩定動脈粥樣硬化斑塊，降低其易損性，理論上可以起到抑制動脈粥樣硬化的作用。

易損斑塊的診斷與治療一直是臨床及科研工作的熱點與難點，本研究旨在探討應用IGF－1對于動脈粥樣硬化斑塊細胞成分的影響，為其應用于控制斑塊易損性提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 動脈粥樣硬化動物模型的制備 雄性新西蘭大白兔18只，隨機分為3組，每組6只，分別為模型組、IGF－1干預組、辛伐他汀干預組。3組動物每天均給予高脂飼料并行球囊拉傷，制作動脈粥樣硬化模型。麻醉實驗動物，解剖分離股動脈。取4F Forgaty球囊插入股動脈。上行插入約30cm，向球囊內注入生理鹽水，向下拖拉球囊至髂總動脈分叉處，反復3次。撤出球囊導管，結扎股動脈，縫合組織及皮膚。術后繼續給予動物高脂飼料喂養10周，同時IGF－1干預組每天給予0．1mg／ml的IGF－1因子1ml腹腔注射，辛伐他汀干預組給予辛伐他汀懸濁液2．5mg／kg灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃。

1．2 取材 注射過量麻醉劑處死實驗動物，解剖取出主動脈固定，縱向剖開動脈，可見動脈粥樣硬化斑塊均勻分布于膈下至髂動脈分叉處，按動物分組做好相應標識備用。

1．3 標本病理組織結構測量 兔主動脈標本固定后，選擇動脈粥樣硬化斑塊最明顯節段，石蠟包埋動脈片段，梯度系列乙醇組織脫水，連續5μm厚度切片，固定在玻片上。組織切片用HE染色，使用NIKON NIS－ELements2．30圖像分析系統采集分析圖像，每個斑塊至少取10處測量纖維帽厚度取平均值，測量處包括最厚與最薄處，測量每個斑塊纖維帽厚度與相對應脂核橫截面厚度。

1．4 免疫組化測定 應用ELISA法進行α－actin單克隆抗體標定平滑肌細胞。每例斑塊標本取4張免疫組化切片，進行平滑肌細胞肌動蛋白免疫組化檢測，顯微鏡觀察，選擇實驗組和對照組的陽性和陰性組織相、進行400×的顯微照相，棕黃色為陽性表達，選擇有意義的組織相，采用多功能真彩色細胞圖象分析管理系統（美國Media Cybernetics公司Image－Pro Plus）進行分析觀察，讀取結果。

1．5 統計學分析 統計學分析使用SPSS16．0軟件包，結果以（ˉx±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為有統計學意義。

2 結果

2．1 斑塊組織結構特點

2．1．1 斑塊大體組織學結構 肉眼觀兔腹主動脈膈水平以下有明顯的連續性動脈粥樣硬化斑塊，按照AHA動脈粥樣硬化分型，可將斑塊分為六型：1型（初始病變），Ⅱ型（脂質條紋病變），Ⅲ型（中間型病變），Ⅳ型（粥樣瘤病變），Ⅴ型（纖維粥樣瘤病變），Ⅵ型（Ⅴ型合并并發病變）。鏡下見各組斑塊表現為Ⅳ型及Ⅴ型斑塊特點，斑塊表面覆蓋纖維帽不明顯，斑塊內平滑肌細胞和膠原含量相對較少。模型組斑塊纖維帽較薄，脂核相對較大，而干預組斑塊纖維帽較厚，脂核相對較小。

2．1．2 測量斑塊纖維帽厚度，脂核厚度，并計算纖維帽厚度與脂核橫截面厚度的比值。IGF－1組與模型組比較，在斑塊肩部及頂部，兩者差異有統計學意義；辛伐他汀組與模型組比較，二者差異有統計學意義，辛伐他汀組與IGF－1組，兩者帽核比均大于模型組帽核比。而IGF－1組與 辛伐他汀組比較，二者差異無統計學意義，結果見表1。

表1 各組間斑塊帽核比（ˉx±s）

2．2 平滑肌細胞免疫組化

2．2．1 病理切片由一名專業人員獨立閱片，相關指標定量使用免疫組化評分（IHS）。已證明，此種方法得出的數據近似于圖像分析為基礎的評分系統［3］。IHS包含了免疫反應陽性細胞百分比分級（質量評分）與陽性細胞顯色強度分級（染色強度評分），結合兩方面綜合計算進行評分。陽性細胞百分比0－1% ＝0；1%－10% ＝1；10%－50% ＝2；50%－80%＝3；80%－100%＝4。陽性細胞顯色強度分別為0（陰性）；1（弱陽性）；2（陽性）；3（強陽性）。IHS評分為兩者評分的乘積，故評分范圍為0到12。IHS評分9－12為強免疫反應，5－8為中等免疫反應，1－4為弱免疫反應，0為無免疫反應。

2．2．2 平滑肌細胞免疫組化評分（IHS）見表2。模型組平滑肌細胞含量明顯較少（圖1A），而IGF－1干預組、辛伐他汀干預組平滑肌細胞含量相對較多（圖1B）。由表2可見，兩干預組平滑肌細胞含量均與模型組有統計學差異，而辛伐他汀組平滑肌細胞含量增多趨勢最明顯。

表1 各組間斑塊平滑肌細胞免疫組化IHS（ˉx±s）

圖1 平滑肌肌動蛋白抗體主要在細胞漿表達（×400）

3 討論

動脈粥樣硬化是導致冠心病和缺血性腦卒中等急性心腦血管事件的主要原因。目前的研究認為，決定患者是否易于發生急性血管事件的關鍵因素是斑塊的穩定性，而不是簡單的斑塊體積大小［4］。動脈粥樣硬化比較嚴重的患者并不一定發生急性血管事件，相反，某些僅造成輕／中度管腔狹窄的斑塊更易于破裂誘發血栓形成，這種斑塊被稱為易損斑塊。易損斑塊通常脂質核心相對較大，而纖維帽相對較薄，更容易發生破裂、潰瘍和糜爛，這些病理改變的直接后果是引發血小板瀑布反應，造成血小板聚集形成血栓。所以，早期進行藥物或其他干預，改善動脈粥樣硬化斑塊的易損性，具有非常明顯的臨床與社會意義。

胰島素樣生長因子1是一種受生長激素調節，與胰島素原有高度同源性的單鏈多肽類生長因子［5，6］。動脈粥樣硬化形成過程中涉及的炎癥細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞均可分泌IGF－1［7，8］。IGF－1能夠改變細胞周期進程，抑制血管SMC凋亡，誘導SMC增殖。Ruiz等人的體外實驗顯示［9］，IGF－1通過與受體結合可以刺激血管平滑肌細胞的增殖和遷移，影響動脈粥樣硬化的進程。SMC可產生膠原，膠原對維持纖維帽的張力和強度非常重要［10］，SMC凋亡會減少膠原產生，從而減弱這種保護作用，使斑塊極不穩定易于破裂。從這個角度而言，IGF－1可以用于改善動脈粥樣斑塊的易損性。

本研究中，平滑肌細胞免疫組化提示，IGF－1組的平滑肌細胞較模型組增多。所以，應用IGF－1可以誘導平滑肌細胞增殖，影響斑塊的組織機構，使易損斑塊的纖維帽厚度得到加強，從而使斑塊破裂的可能性下降，達到穩定斑塊的目的。他汀類降脂藥對于動脈粥樣硬化斑塊的穩定作用已得到大量基礎及臨床試驗的證實。本研究中，IGF－1組與他汀組在改善斑塊結構方面無明顯差異，但是總體趨勢并不優于他汀，在調整IGF－1應用劑量及使用途徑后是否能夠優于他汀類藥物，是本研究未來將要探索的方向之一。

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