2株B型副雞禽桿菌的分離鑒定

楊國良，鄭 杰，張 洪，龍進學，張發明，張 坦，孫豐廷，鄧秋紅，張 紅，王文泉

(北京華都詩華生物制品有限公司，北京 102600)

雞傳染性鼻炎(Infectious Coryza，IC)是由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)引起雞的一種急性呼吸道疾病，該病可使育成雞生長發育不良和產蛋雞產蛋明顯下降(可引起產蛋率下降10% ～40%)［1］。在我國主要發生在北京、西安等一些北方的養殖場，在南方很少有報道［2］。其主要特征是發病率高而死亡率低，但飼養環境惡劣、寄生蟲、營養不良或伴發其他疾病，如禽痘、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎等，可使傳染性鼻炎的病情加重，持續時間會更長，引起死亡率增加［3－4］。由于康復的帶菌雞是主要的傳染源，所以不提倡從不明來源的地方購買種公雞和開產雞的習慣做法，除非知道雞群來源于無傳染性鼻炎雞場，否則只應購買1日齡雞作為后備雞。預防和控制本病的理想措施是遠離老雞群進行隔離飼養。要從雞場中徹底消除病原，必須首先清除感染雞或康復雞，對禽舍和設備進行清洗和消毒后，在重新飼養清潔雞之前，禽舍應空閑2～3周。

按照Page平板凝集試驗的分型方法，副雞禽桿菌可分為A、B和C三個血清型。各型之間不產生交叉保護［5］，一種血清型制備的菌苗免疫雞，只能對同源菌的攻擊提供保護。2003年張培君等在遼寧首次分離到了B型副雞禽桿菌［6］，結合本次北京所分離到的2株B型副雞禽桿菌，說明我國B型Apg的存在已經不局限于某地的暴發，而是有蔓延的趨勢。這就要求現階段養殖戶在免疫時有必要將傳染性鼻炎疫苗與目標雞群中存在的血清型相匹配，這樣才能達到最理想的免疫效果，從而防止蔓延?；诖?，我國應該積極研制B型副雞禽桿菌的單苗或聯苗，以打破國內以A型、C型單雙價滅活疫苗為主的格局。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 標準菌株 C－Apg－8(Page A型)由中國獸醫藥品監察所提供。

1．1．2 鼻炎疫苗 雞傳染性鼻炎(A型)滅活疫苗由北京華都詩華生物制品有限公司提供。

1．1．3 培養基 雞肉湯培養基、雞肉湯瓊脂、半合成培養基參照馮文達等的方法制備［7］。

1．1．4 主要試劑及試劑盒 DNA Marker、DNA聚合酶、dNTPs，TaKaRa公司;其他試劑均為國產分析純，均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

1．1．5 病料信息 病雞來源于北京平谷和延慶某公司雞場，具有雞傳染性鼻炎的臨床癥狀。主要表現為臉部腫脹，鼻孔有粘性分泌物流出，有時打噴嚏，食欲及飲水減少，體重減輕，精神沉郁，縮頭，呆立。6 d內蔓延全群，85%的雞出現癥狀。

1．2 方法

1．2．1 菌株分離 將具有典型臨床癥狀的病雞處死，雞頭表面消毒，無菌切開眶下竇，用接種環蘸取眶下竇內容物，在含有NAD(輔酶Ⅰ、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的雞血清瓊脂平板上劃線，同時接種普通肉湯和普通瓊脂平板作為對照，然后將平皿倒置于37℃ 5%CO2培養箱內培養16～20 h，挑取單個可疑菌落進行純培養，同時將純培養產物作為研究對象，進行下一步鑒定。

1．2．2 無雜菌檢驗 將北京平谷、延慶所分離的可疑菌落純培養物接種葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面、硫乙醇酸鹽(TG)小管各2支，每支0．2 mL，其中1支置37℃培養，1支置25℃培養，觀察3～5 d。

1．2．3 過氧化氫酶試驗 挑取典型的菌落進行過氧化氫酶試驗，如有氣泡即為陽性反應。

1．2．4 種子液活菌計數方法 采用微量點板計數法。選擇適宜的四個稀釋度，每個稀釋度接種2點，接種量為10μL，接種含有NAD的雞血清瓊脂平板使其自然擴散。于CO2培養箱培養18～24 h(37℃、5%CO2)。依照 GB4789．2－94中的方法開展活菌計數。

1．2．5 PCR鑒定方法 按常規方法處理細菌培養物，將上述培養物取2μL作為模板，進行 PCR。PCR程序參照陳小玲等的方法進行:98℃變性2．5 min。反應過程為94℃ 1 min，65℃ 1 min和72℃2 min，循環25次，然后94℃ 1 min，65℃ 1 min，72℃ 10 min循環1次。PCR產物經0．8%瓊脂糖凝膠電泳分析［8］。

1．2．6 引物合成 根據陳小玲等發表文章中已知的引物序列［9］，由Invitrogen北京分公司合成。上游引物P1:5’－TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT－3’;下游引物 P2:5’－ CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT －3’。

1．2．7 回歸試驗 取培養至對數生長期的新鮮菌液，經過活菌計數并且將其稀釋至規程要求的范圍，眶下竇接種70日齡的SPF雞，其中試驗組和對照組分3個隔離器飼養，接種后逐日觀察其臨床表現。試驗情況見表1。

表1 攻毒情況記錄表

1．2．8 免疫攻毒試驗 取60～90日齡SPF雞28只，其中免疫組、對照組在分別接種A型鼻炎疫苗、PBS 30 d后各眶下竇內注射平谷株、延慶株以及A型細菌培養物，分5個隔離器飼養，觀察14 d，試驗情況見表2。

表2 免疫攻毒情況記錄表

1．2．9 水平傳播試驗 取60～90日齡SPF雞40只，其中6只一組(3只作為攻毒組，3只作為PBS對照組)，14只一組(3只作為攻毒組，11只作為PBS對照組)，分別放入飼養面積相同的1～4號隔離器中飼養。每組雞按要求各眶下竇內接種平谷株、延慶株細菌培養物，接種后逐日觀察其臨床表現，試驗情況見表3。

表3 Apg水平傳播試驗記錄表

1．2．10 分離菌株血清型鑒定 將菌株用20%甘油保存，送匈牙利詩華研發中心代為鑒定。

1．2．11 序列測定與分析 從瓊脂糖中回收PCR產物目的片段，用雙脫氧法直接對PCR產物進行測序，為了保證序列準確性，同時反向測定序列加以驗證。并將所測定的2株B型副雞禽桿菌基因序列與NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)相應序列進行比較分析。

2 結果

2．1 細菌分離及初步鑒定 從平谷、延慶可疑病雞眶下竇內各分離到1株細菌，此菌在含有NAD的雞血清瓊脂平板上形成邊緣整齊、半透明露滴狀的小菌落，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長。挑取可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡下可見兩級濃染的革蘭氏陰性短桿菌。過氧化氫酶試驗結果均為陰性，無雜菌檢驗顯示葡萄糖蛋白胨(GP)、酪胨瓊脂(GA)斜面上均無菌生長，硫乙醇酸鹽(TG)小管有輕微細菌生長。

2．2 PCR反應結果 如圖1所示，平谷、延慶菌株與標準陽性對照菌株、陰性對照一起，經PCR儀按照設定程序擴增后，經0．8%瓊脂糖凝膠電泳25 min，結果顯示分離菌株與標準陽性對照菌株均在0．5 kb位置出現了大小相同的DNA條帶，與預期的擴增片段大小一致。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結果

2．3 回歸試驗 用平谷、延慶分離菌株人工感染SPF雞24 h后均出現食欲減退、眶下竇及臉部嚴重腫脹、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發病癥狀。在感染雞的眶下竇內又重新分離到了副雞禽桿菌菌落。剖檢病變主要為兩側眶下竇內有粘液樣物質分泌，眼結膜充血。接種PBS的對照雞，至觀察結束未出現IC發病癥狀。

2．4 免疫攻毒試驗 副雞禽桿菌平谷株對照組4/4發病，免疫組1/8保護為不合格;延慶株對照組4/4發病，免疫組0/8保護為不合格(根據《中華人民共和國獸藥典》:對照組4/4發病，免疫組6/8保護為合格。對照組3/4發病，免疫組7/8保護為合格)。而接種A型疫苗+A型菌液的對照組100%保護(4/4)。

2．5 水平傳播試驗 1、3號隔離器中的攻毒組3/3發病，對照組至觀察結束未見IC發病癥狀。2、4號隔離器中的攻毒組3/3發病，對照組在攻毒后第5天相繼出現了食欲減退、臉部腫脹、流鼻涕、打噴嚏等IC發病跡象。隨后對2、4號隔離器中對照組雞進行細菌的分離培養及PCR檢測鑒定，證明所分離到的菌株為副雞禽桿菌。

2．6 血清型鑒定結果 將所分離到的平谷株、延慶株Apg經匈牙利詩華研發中心代為鑒定，其結果為B型副雞禽桿菌。

2．7 序列測定與分析結果 經序列測定，克隆的PCR產物長度為500 bp，與預期的擴增片段長度相符。應用DNASTAR軟件進行基因核苷酸序列遺傳距離分析，結果顯示平谷株、延慶株基因序列同源性達到99．6%，而與 NCBI基因庫中參考株(GenBank登錄號:DQ132874．1)Modesto的基因序列同源性達到98．3%、98．8%，結果見圖2。

圖2 B型副雞禽桿菌基因核苷酸序列遺傳距離分析結果

3 討論

3．1 本試驗中分離菌在含NAD的雞血清瓊脂平皿上呈露滴狀生長，在普通肉湯和普通瓊脂平皿上不生長;革蘭氏染色為陰性短桿菌，兩極濃染;過氧化氫酶試驗結果為陰性;無雜菌檢驗顯示在GA、GP上均無菌生長，但在TG小管中有輕微細菌生長;將分離菌人工感染SPF雞24 h后均出現眶下竇及臉部嚴重腫脹、食欲減退、呆立、鼻孔有粘液流出等典型的IC臨床發病癥狀，同時在感染雞的眶下竇內又重新分離到了副雞禽桿菌;在PCR結果陽性的基礎上，用已知Apg A型鼻炎滅活疫苗免疫SPF雞后接種平谷、延慶分離菌株，均不能保護，而接種A型菌株的對照組100%保護(4/4)證明所分離到的Apg肯定不是A型。為了進一步驗證分離物，將分離到的Apg送匈牙利詩華研發中心代為鑒定。鑒定結果與攻毒保護試驗結果一致，可以判定該分離物為B型副雞禽桿菌，暫命名為副雞禽桿菌平谷株和延慶株。

3．2 雞傳染性鼻炎傳播途徑主要以飛沫及塵埃經呼吸傳播，本次傳播試驗中，使用相同面積飼養的1、3號隔離器內的6只雞沒有發生水平傳播現象，而2、4號隔離器內的14只雞在攻毒后第5天相繼出現了精神沉郁、食欲減退、鼻孔有粘性分泌物流出、臉部腫脹、打噴嚏、縮頭、呆立等IC發病跡象。由此可見，本病的發生和反復發作與飼養密度有很大的關系。

3．3 由免疫攻毒試驗得知，傳染性鼻炎A型滅活疫苗免疫過的SPF雞對平谷、延慶分離菌株的攻擊沒有起到保護作用，此結果與該菌株的血清型的鑒定結論一致。由于滅活的雞傳染性鼻炎疫苗只提供針對疫苗中含有的Page血清型的保護，因此菌苗中關鍵要含有目標雞群中存在的血清型。Page B型已經證實是一種真正存在的具有完全致病性的血清型，并且發生很廣，這就是說，在存在血清型B的地區使用的滅活菌苗中必須含有這一血清型。然而，由于血清型B的不同菌株間只能提供部分交叉保護［10］，因此在血清型B流行的地區有必要加快雞傳染性鼻炎多價疫苗的研究。

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