ELISA試劑盒用于檢測(cè)豬尿中賽庚啶殘留的考察

張 鑫，吳劍平，顧 欣，李丹妮，嚴(yán) 鳳

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

賽庚啶(Cyproheptadine，CYP)是一種人用藥，在臨床上用于治療過(guò)敏反應(yīng)導(dǎo)致的皮炎等疾病，由于該藥具有可抑制下丘腦的飽覺(jué)中樞而刺激食欲的作用［1－2］，可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。2010 年，上海市獸藥飼料檢測(cè)所首次發(fā)現(xiàn)CYP被一些不法畜牧養(yǎng)殖企業(yè)作為新型養(yǎng)殖促進(jìn)劑非法使用，而CYP在畜產(chǎn)品中的殘留對(duì)消費(fèi)者的健康極有危害。2010年底，中國(guó)農(nóng)業(yè)部第1519號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)》明確禁止使用該類藥物作為家畜的生產(chǎn)促進(jìn)劑，2012年，上海市和江蘇省率先開(kāi)展了地產(chǎn)生豬出欄前CYP監(jiān)測(cè)。

動(dòng)物口服CYP后40%以上由尿液排泄，主要為原形藥物及葡萄糖醛酸結(jié)合的季銨鹽型CYP，不同動(dòng)物的尿液中代謝物成分含量有所不同。可通過(guò)檢測(cè)豬尿中的CYP殘留以監(jiān)控其在養(yǎng)殖業(yè)的非法使用。當(dāng)前用作CYP殘留檢測(cè)的儀器方法為HPLC 或 LC/MS/MS 法［3－5］，檢測(cè)對(duì)象為接受 CPY治療的人或動(dòng)物的血、尿或奶，最低檢測(cè)限為0．1μg/L。但其前處理步驟復(fù)雜，成本較高，不適于日常監(jiān)測(cè)及大規(guī)模篩查。

ELISA試劑盒可經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)尿中的藥物殘留，但目前市場(chǎng)上可采購(gòu)的CYP檢測(cè)ELISA試劑盒均未標(biāo)明適合檢測(cè)豬尿樣品。進(jìn)口試劑盒(代號(hào)分別為A、B、C)在國(guó)外用于檢測(cè)人或馬用藥后的CYP含量情況，國(guó)產(chǎn)試劑盒(D)是由進(jìn)口抗體在國(guó)內(nèi)分裝生產(chǎn)，未明確說(shuō)明適用于豬尿檢測(cè)，因此，四種試劑盒用于豬尿的檢測(cè)限與標(biāo)示可能不符。試驗(yàn)通過(guò)考察四種試劑盒的反應(yīng)原理、可操作性、靈敏度、檢測(cè)限、回收率等，了解國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上CYP試劑盒的質(zhì)量現(xiàn)狀，探討使用ELISA試劑盒監(jiān)測(cè)豬尿中CYP殘留的可行性，給出參考的檢測(cè)限。由于國(guó)內(nèi)豬尿中CYP殘留檢測(cè)工作剛剛起步，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺(tái)，因此，本試驗(yàn)為CYP監(jiān)測(cè)工作提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器及試劑 高速離心機(jī)，型號(hào)Sigma 1－14;酶標(biāo)儀，型號(hào)BioTek ELX808。CYP試劑盒A、B、C、D，市售購(gòu)得。CYP標(biāo)準(zhǔn)品，純度98%，購(gòu)自美國(guó)sigma公司。

1．1．2 試料 豬尿20份，采自上海市青浦區(qū)三家豬場(chǎng)。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 試樣的制備 空白樣品 20份豬尿陰性樣品經(jīng)LC/MS/MS法確證為CYP陰性樣品。

空白添加樣品 取陰性豬尿樣品，添加CYP標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液制成濃度為 0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L的陽(yáng)性樣品各6份。

將空白及空白添加的豬尿液8000 r/min離心5 min，并根據(jù)各試劑盒對(duì)樣品的要求進(jìn)行稀釋或直接測(cè)試。

1．2．2 試劑盒反應(yīng)原理 吸附在孔內(nèi)的抗原和標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中賽庚啶與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，與標(biāo)品或樣品中賽庚啶相結(jié)合的抗體被洗滌去除后，孔內(nèi)抗原結(jié)合的抗體與酶標(biāo)記的第二抗體相結(jié)合，酶底物在酶作用下顯色，在450 nm下吸光度的高低與樣品中賽庚啶的含量成反比。

1．2．3 試劑盒操作步驟 四種試劑盒的反應(yīng)原理基本一致，操作步驟及反應(yīng)時(shí)間有細(xì)微差異，僅把有區(qū)別的步驟列表如下。試劑盒的反應(yīng)時(shí)間通常在75～100 min之間。

表1 四種試劑盒的操作步驟及反應(yīng)時(shí)間差異比較

1．2．4 靈敏度、檢測(cè)限、準(zhǔn)確度 試劑盒的靈敏度由50%抑制濃度(IC50)體現(xiàn)。測(cè)定5次標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出每條標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50。測(cè)定20份陰性尿液樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出CYP的測(cè)定值，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。檢測(cè)限為平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出豬尿中CYP的檢測(cè)限。準(zhǔn)確度以回收率表示。取CYP空白添加豬尿樣本，每個(gè)濃度做6次平行檢測(cè)，計(jì)算豬尿中CYP的平均回收率。

1．2．5 與不同分析方法的比較 參照文獻(xiàn)［4］提供的HPLC/MS/MS法對(duì)空白及陽(yáng)性添加豬尿進(jìn)行檢測(cè)，與試劑盒檢測(cè)結(jié)果做比較。

2 結(jié)果

2．1 50%抑制濃度(IC50) 四種試劑盒IC50的差異較大，范圍為0．119 ～0．965 μg/L，結(jié)果見(jiàn)表2:

表2 四種試劑盒的IC50 μg/L

2．2 檢測(cè)限 20份空白豬尿中CYP的測(cè)定均值及試劑盒的檢測(cè)限見(jiàn)表3，試劑盒C與標(biāo)示不符。

表3 豬尿中CYP檢測(cè)限與定量限 μg/L

2．3 準(zhǔn)確度 豬尿中CYP的四個(gè)添加濃度(0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L)的檢測(cè)準(zhǔn)確度見(jiàn)表 4。

表4 CYP陽(yáng)性質(zhì)控豬尿樣品檢測(cè)準(zhǔn)確度 (n=6)

2．4 與儀器方法的比較 LC/MS/MS法檢測(cè)CYP濃度為0．1、0．5 和1．0 μg/L 的陽(yáng)性添加豬尿樣品的結(jié)果與試劑盒測(cè)試值的比較見(jiàn)表5。

表5 陽(yáng)性添加豬尿樣品中CYP的測(cè)試值

3 討論

3．1 由于是ELISA半定量試劑盒，定量通常不夠準(zhǔn)確，在CYP添加濃度較低時(shí)，其回收率更多反映的是試劑盒本身的抗干擾能力及靈敏度。試劑盒A、B的靈敏度較高，IC50＜0．5μg/L，抗體特異性較好。數(shù)據(jù)顯示，試劑盒A、B、D的檢測(cè)限均低于0．5μg/L，可考慮該法的檢測(cè)限定為0．5μg/L，同時(shí)為排除假陽(yáng)性，含量在檢測(cè)限以上的樣品應(yīng)由LC/MS/MS定性及定量。

試劑盒A、D在檢測(cè)CYP添加濃度≥0．5μg/L的樣品時(shí)有較穩(wěn)定的回收率。試劑盒B檢測(cè)限＜0．5μg/L，但回收率偏高。試劑盒C檢測(cè)限及回收率均不能達(dá)到要求，不適于豬尿中賽庚啶的檢測(cè)。3．2 研究數(shù)據(jù)顯示，在日常監(jiān)測(cè)中使用的大部分市售的ELISA試劑盒可以滿足CYP篩查需要，但仍有以下問(wèn)題需要注意:

選用試劑盒之前應(yīng)對(duì)其性能參數(shù)進(jìn)行全面的考察。例如，實(shí)驗(yàn)得到的檢測(cè)限與商品標(biāo)示的檢測(cè)限可能并不相符。進(jìn)口試劑盒在國(guó)外用于馬、狗、人等用藥后尿液及血液的檢測(cè)，其檢測(cè)限很可能不適合CYP非法添加飼喂監(jiān)測(cè)的需要，需注意甄別。

通過(guò)考察了解試劑盒的特點(diǎn)，在批量檢測(cè)樣品時(shí)為結(jié)果判斷提供依據(jù)。例如，試劑盒A的IC50和檢測(cè)限都很低，回收率穩(wěn)定，在較低濃度范圍內(nèi)有較好的線性，試劑盒B檢測(cè)限較低，回收率卻偏高，這對(duì)定量不利，卻對(duì)定性有幫助，試劑盒D的IC50和檢測(cè)限都較高，但在較高濃度范圍內(nèi)有較好的線性，因此不同試劑盒之間可以互補(bǔ)，在實(shí)際監(jiān)測(cè)工作中應(yīng)至少配備兩個(gè)品牌以上的試劑盒交替使用。

由于不同物種尿液中CYP及其代謝物的含量不同，本文使用標(biāo)準(zhǔn)品添加實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)有一定局限性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論可能不同。由于ELISA方法的局限性，仍存在基質(zhì)干擾或假陽(yáng)性的可能，所以對(duì)CYP含量大于0．5μg/L的樣品需進(jìn)行LC/MS/MS法確證實(shí)驗(yàn)。

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