應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)豬傳染性胃腸炎病毒

邱文英，方鵬飛，胥燕芳，潘華柱，徐 靜，郝偉偉

(四川省華派生物制藥有限公司，四川簡陽 641400)

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，有囊膜，具多形性，病毒的成熟發(fā)生于細胞漿中［1］。該病毒可引發(fā)豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)，豬感染后主要出現(xiàn)嚴重嘔吐、腹瀉和脫水等特征。

目前疫苗用TGEV的培養(yǎng)多采用ST傳代細胞［2］，而傳統(tǒng)的ST細胞培養(yǎng)方式多采用克氏瓶及轉(zhuǎn)瓶，該方法存在病毒生產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大等缺點，因此克氏瓶及轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)已不能完全滿足現(xiàn)代生物疫苗生產(chǎn)的要求。1967年Wezel首次成功的應(yīng)用DEAE Sephadex A50作載體實現(xiàn)兔原代細胞、人二倍體細胞等的懸浮培養(yǎng)［3］，此后世界各國都陸續(xù)投入到細胞的微載體培養(yǎng)研究。應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)貼壁細胞具有高比表面積、細胞產(chǎn)量高，便于監(jiān)測、控制和取樣，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易染菌等優(yōu)點［4］。同時，生物反應(yīng)器可減少生產(chǎn)人員，提高生產(chǎn)效率，無論人用還是獸用疫苗領(lǐng)域均在開展生物反應(yīng)器制備疫苗的生產(chǎn)工藝摸索［5－6］。

研究使用7 L生物反應(yīng)器進行TGEV的培養(yǎng)，旨在進行生物反應(yīng)器培養(yǎng)TGEV工藝的摸索，為進一步使用大容積生物反應(yīng)器進行TGEV的培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 種毒 TGEV由四川省華派生物制藥有限公司分離及保存。

1．2 ST細胞 中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1．3 生物反應(yīng)器及微載體 7 L生物反應(yīng)器，廣州齊志生物設(shè)備有限公司，微載體CytodexⅠ，GE公司。1．4 血清及試劑 新生牛血清，杭州市四季青生物工程材料研究所，MEM，宜興市賽爾生物科技有限公司，胰酶，Gibco公司。

1．5 ST細胞在生物反應(yīng)器上的培養(yǎng) 將微載體加入至 7 L生物反應(yīng)器中(2012001，3 g/L;2012002，6 g/L;2012003，9 g/L)，并將消化后的 ST細胞加入至反應(yīng)器中。將細胞培養(yǎng)條件設(shè)置為:培養(yǎng)溫度，37℃;pH值7．2;溶氧為50%空氣飽和度;攪拌速度40 r/min;培養(yǎng)體積4 L。每批均采用灌流方式進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況調(diào)節(jié)灌流速度。每日取樣使用胰酶進行細胞的消化，以確定細胞生長密度。

1．6 TGEV在生物反應(yīng)器上的培養(yǎng) 待微載體上的細胞長滿至單層后，將培養(yǎng)基更換為細胞維持液，接種TGEV毒種，培養(yǎng)體積為5 L。采用灌流方式進行培養(yǎng)，細胞開始出現(xiàn)病變后，每隔3 h取樣進行TCID50的測定，細胞病變至80%時收獲病毒液。

1．7 TGEV在轉(zhuǎn)瓶上的培養(yǎng) 將消化后的ST細胞加入至15 L轉(zhuǎn)瓶中，放至37℃進行培養(yǎng)。待細胞長滿至單層后，傾棄培養(yǎng)液，加入1．2 L細胞培養(yǎng)液，并加入TGEV液。每隔3 h取樣進行TCID50的測定，當(dāng)細胞病變至80%時收獲病毒液。

1．8 TCID50測定 將樣品用培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取 10－5、10－6、10－7、10－8稀釋度接種至 ST 單層細胞中。120 h后觀察結(jié)果，計算病毒的TCID50。

2 結(jié)果

2．1 ST細胞在生物反應(yīng)器上的培養(yǎng) 經(jīng)過72 h的培養(yǎng)，細胞長滿至單層。接種細胞至微載體后6 h細胞貼壁，三次培養(yǎng)細胞的最高密度分別為2．14×106個/mL，1．83 ×106個/mL，2．02 ×106個/mL(圖1)。3批培養(yǎng)細胞的種子細胞數(shù)量不同，但采用相同的參數(shù)進行控制，3批細胞的最大細胞密度及達到最大細胞密度的時間有所不同。這表明細胞種子量對細胞生長及細胞密度有重要的影響，這與王建超［6］和李平忠［8］報道的使用生物反應(yīng)器進行Vero細胞的培養(yǎng)結(jié)果一致。

圖1 生物反應(yīng)器中ST細胞生長情況

2．2 TGEV在生物反應(yīng)器上的培養(yǎng) 3次使用生物反應(yīng)器培養(yǎng)TGEV的過程中，接種病毒15 h左右，ST細胞病變開始出現(xiàn)病變，接種21～24 h細胞病變至60% ～70%，此時TGEV含量達到最高，均大于108．0TCID50/mL，接種病毒27 h左右后細胞病變達到80%左右，TCID50略有下降，但TGEV含量仍大于108．0TCID50/mL(見圖3)。3次培養(yǎng)均收獲5 L病毒液。

2．3 TGEV在轉(zhuǎn)瓶上的培養(yǎng) 接種TGEV后12 h時細胞開始出現(xiàn)病變，此時測定病毒含量為104．3TCID50/mL，21 h左右時細胞病變達到80%左右，測定病毒含量為106．5TCID50/mL，病毒含量最高，24 h后病毒含量開始下降(見圖5)。每個轉(zhuǎn)瓶收獲1．2 L病毒液。

3 討論

60年代起中國開始出現(xiàn)TGE的報道，近些年來有進一步流行的趨勢，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行，TGEV仍是現(xiàn)今引起仔豬發(fā)病和死亡的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大困擾［9，10］。目前對于 TGEV仍缺乏有效的臨床治療藥物，采用疫苗免疫接種是主要的預(yù)防措施。在培養(yǎng)細胞制備弱毒疫苗時，傳統(tǒng)方式一般采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)TGEV，但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中pH值、營養(yǎng)液成分隨時間而發(fā)生變化，這可能是造成病毒含量不能進一步提高的原因。生物反應(yīng)器能較好地控制溫度、溶氧及pH值等，使病毒在更加穩(wěn)定的環(huán)境中進行增殖，加之連續(xù)進行的灌流培養(yǎng)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)不斷得到補充，代謝廢物不斷移出，使培養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，因而細胞密度和病毒的產(chǎn)量都大大提高。

正是由于生物反應(yīng)器較轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)越性，生物反應(yīng)器系統(tǒng)得到廣泛研究，以便應(yīng)用于人用及獸用疫苗生產(chǎn)中，如狂犬病病毒［6］，甲型肝炎病毒［11］，圓環(huán)病毒［12］等，均在研究中取得了較為理想的結(jié)果。本試驗采用生物反應(yīng)器及微載體系統(tǒng)進行TGEV的培養(yǎng)，培養(yǎng)的TGEV含量明顯高于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。試驗中使用7 L的生物反應(yīng)器可一次性生產(chǎn)收獲5 L病毒液，所得TGEV抗原約相當(dāng)于132個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)所得到得抗原。同時，7 L生物反應(yīng)器可作為更大體積生物反應(yīng)器的種子罐，因此試驗也為使用更大體積的生物反應(yīng)器培養(yǎng)TGEV奠定了一定基礎(chǔ)。

生物反應(yīng)器通常采用全封閉管道化操作及全自動化監(jiān)控，可以有效降低細胞的污染率及人為因素造成的影響，另外生物反應(yīng)器容積較大，可使終端產(chǎn)品更加均一，同時結(jié)合后期純化工藝，不但產(chǎn)品產(chǎn)量明顯提高，而且產(chǎn)品的質(zhì)量更加穩(wěn)定，生物反應(yīng)器的大規(guī)模使用將成為一種必然趨勢。

［1］ 陳溥言．獸醫(yī)傳染性病學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，225－228．

［2］ 斯特勞，阿萊爾，蒙加林，等．豬病學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000，316 －319．

［3］ 何孔旺，林繼煌，還紅華，等．豬傳染性胃腸炎病毒弱毒株STc3細胞培養(yǎng)特性及致病性研究［J］．中國獸醫(yī)科技，2001，31(8):8－9．

［4］ Van Wezel．Growth of cell strains and primary cells onmicrocarriers［J］．Nature，1967，216:64 －65．

［5］ Perrin P，Madhusudana S，Gontier－ Jallet C，et al．An experimental rabies vaccine produced with a new BHK－21 suspension cell culture process:use of serum free medium and perfusion reactor system［J］．Vaccine，1995，13(13):1244 －1250．

［6］ 李平忠，沈 偉，余 芬，等．用微載體培養(yǎng)Vero細胞制備狂犬疫苗［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，28(23):2374 －2376．

［7］ 石 崗，王宏俊，孫惠玲．利用生物反應(yīng)器和Vero細胞培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病病毒的研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35(9):1134－1138．

［8］ 王建超，周 燕，華 平，等．應(yīng)用生物反應(yīng)器和微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)豬流行性腹瀉病毒的研究［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2003，34(6):573 －376．

［9］ Sirinarumitr T，Siddell S，Grahare F，et al．Porcine transmissible gastroenteritis virus induced apoptosis in swine testes cell cultures［J］．Archives of Virology，1998，143(12):2471 － 2485．

［10］ Jones T，Shenk T．Transmissible gastroenteristis virus of pigs［J］．Veterinary Record，1997，141(16):427 －428．

［11］孫明波，李國良，李衛(wèi)東，等．應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細胞制備甲肝病毒［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，25(4):740－741．

［12］何錫忠，李春華，倪建平，等．用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)PK15細胞生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒［J］．上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，26(4):149 －151．