克侖特羅酶聯免疫試劑盒的比較評價

王鶴佳，劉智宏，金銀珍，汪 霞，徐士新

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

克侖特羅(Clenbuterol)是一種β－受體激動劑，在臨床上用于防治支氣管哮喘以及哮喘型慢性支氣管炎、肺氣腫等疾病［1］。由于其能顯著降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，曾在畜牧業上作為促生長劑而廣泛使用。克侖特羅具有較大毒性，人們食用克侖特羅高殘留的動物性食品后，可導致心悸、頭痛、惡心、嘔吐、血管擴張和肌肉震顫等中毒癥狀。農業部176號公告規定，禁止在飼料和動物飲用水中使用克侖特羅［2］。農業部193號公告規定克侖特羅禁用于所有食品動物的所有用途［3］。農業部235號公告規定，禁止使用克侖特羅及其鹽、酯，且在動物性食品中不得檢出［4］。

目前檢測動物性食品中克侖特羅殘留的確證方法主要為液相色譜－質譜聯用法和氣相色譜－質譜聯用法。但由于需要昂貴的儀器設備，且前處理步驟復雜，成本較高，不利于基層單位的日常監測和大規模篩查。而酶聯免疫(ELISA)試劑盒可經濟、快速地檢測動物性食品中的克侖特羅。實驗比較了市售18個廠家的試劑盒，用于豬尿中克侖特羅殘留檢測時，在可操作性、靈敏度、準確度、精密度等參數［5，6］上的差異，為了解國內市場上克侖特羅酶聯免疫試劑盒的現狀提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料 不同來源豬尿樣品20份，采自陜西省和寧夏回族自治區屠宰場。市售18個廠家的克侖特羅ELISA試劑盒，每個廠家選擇一個批次的產品(產品代號為A－R)。鹽酸克侖特羅標準品，純度98．5%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司。

1．2 儀器 高速冷凍離心機，型號Ttettich;酶標儀，型號Sunrise。

1．3 方法

1．3．1 試料的制備 空白試料 20份不同來源豬尿樣品經液相色譜－串聯質譜法［7］確證為不含β－受體激動劑的空白試料。

陽性添加試料 取經儀器方法確證的空白試料，添加克侖特羅標準溶液，制成濃度為1μg/L的陽性添加試料。按上述方法配制6個樣品。

1．3．2 檢測方法 樣品前處理方法 將空白試料和陽性添加試料分別于5000 r/min離心5 min，取上清液備用，按照試劑盒各自說明書要求對樣品進行稀釋后測定或直接測定。

試劑盒操作步驟 按照試劑盒各自說明書進行操作。

1．3．3 靈敏度 IC50測定標準曲線，得到該標準曲線的IC50。IC50為50%抑制濃度即B/B0=50%時所對應的濃度，用于衡量抗體靈敏度，IC50越低說明抗體的靈敏度越高。

檢測限 測定20份空白試料，計算測定值的平均值和標準差。豬尿中克侖特羅的檢測限為平均值加3倍標準差［8］。

1．3．4 準確度和精密度 取6個陽性添加試料進行測定，計算豬尿中克侖特羅的平均回收率和變異系數［8］。陽性添加回收率=實測濃度/添加濃度×100%。

2 結果

2．1 試劑盒可操作性 18個試劑盒中，15個產品都采用一步法，操作時間均在1 h左右，基本不需要樣品前處理步驟，可直接用于測定。結果見表1。

表1 操作步驟比較結果

續表

2．2 靈敏度 18個試劑盒的豬尿中克侖特羅檢測限范圍為 0．26 μg/L ～2．3 μg/L，IC50濃度范圍為0．25 μg/L～2．1 μg/L，標準曲線濃度范圍為0～25 μg/L。結果見表2。

表2 試劑盒靈敏度及標準曲線范圍(μg/L)

2．3 準確度和精密度 18個試劑盒的豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加回收率范圍為61．0% ～378%，平均回收率范圍為78．8% ～321%，變異系數為2．4% ～18．3%。結果見表3。

表3 豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加回收率和變異系數(%)

續表

2．4 試劑盒綜合比較 18個試劑盒在檢測限、回收率、變異系數和操作時間等參數的綜合比較［8］，(評價參數指標未說明)結果見表4。

表4 試劑盒綜合比較表

3 討論

3．1 靈敏度 市售的18個廠家試劑盒用于豬尿中克侖特羅殘留檢測的檢測限范圍為0．26μg/L～2．3μg/L。2012年農業部《全國農產品質量安全例行監測方案》和《動物及動物產品獸藥殘留監控計劃》中規定豬尿中克侖特羅殘留的判定限均為1μg/L。作為篩選方法，目前市售試劑盒在豬尿中的檢測限大部分都能夠達到1μg/L，但有5個產品的檢測限大于1μg/L。

目前市售試劑盒標稱的靈敏度多以試劑盒提供的標準溶液中的最低濃度表示，并非實際樣品的檢測限。此外，不同組織樣品的檢測限也有所不同，有些產品說明書中用同一數據覆蓋所有組織樣品，準確性有待提高。

3．2 準確度和精密度 市售的18個廠家試劑盒在豬尿中克侖特羅1μg/L濃度添加試驗中，平均回收率范圍為78．8% ～321%。豬尿基質組成復雜，對酶聯免疫檢測結果影響較大，回收率可有效反映試劑盒本身的抗干擾能力。實驗考察的18個廠家試劑盒中，9個廠家試劑盒的添加回收率在60% ～120%之間。

選取不同廠家試劑盒的一個批次的產品進行試驗，計算得到的變異系數反映了試劑盒的批內變異情況，變異系數范圍為2．4% ～18．3%。

3．3 操作便利性 市售18個廠家的試劑盒中，15個產品都采用一步法，其中大部分產品的操作時間都在1 h左右，尿樣不需要酶解等前處理步驟，可直接用于測定，便于日常監測和大規模篩查。

3．4 綜合評價 近年來，國產克侖特羅酶聯免疫試劑盒質量大幅提升，在靈敏度、準確度等方面均可滿足目前的日常檢測需要。與此同時，試劑盒品種繁多，質量良莠不齊，建議在選擇試劑盒前對其重要的性能參數進行考察。

［1］ 張家銓，程 鵬．常用藥物手冊［M］．第4版．北京:人民衛生出版社，2011．

［2］ 農業部176號公告．禁止在飼料和動物飲水中使用的藥物品種目錄［S］．

［3］ 農業部193號公告．食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單［S］．

［4］ 農業部235號公告．動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．

［5］ Sabine Hahnau，Bernd Julicher．Evaluation of commercially available ELISA test kits for the detection of clenbuterol and otherβ2－agonists［J］．Food Additives and Contaminants，1996，13:259 －274．

［6］ 葉 妮，劉智宏，郭文林，等．國內外克倫特羅ELISA檢測試劑盒評價［J］．中國獸藥雜志，2002，36(10):25 －28．

［7］ 農業部1025號公告－18－2008．動物源性食品中β－受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯質譜法［S］．

［8］ 農醫發［2005］17號．關于發布《獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)備案審查技術資料要求》和《獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)備案參考評判標準》的通知［S］．