兒童口服液對小鼠免疫功能的影響

黃生權，甘海寧，賴煥玲

兒童口服液由枸杞子、茯苓、香菇、山楂、金針菇、紅棗等10余種藥食同源的中草藥配伍，針對少年兒童生長發育過程中的生理特點，運用現代高新技術精制而成，富含多種氨基酸、維生素及微量元素可提升兒童抵抗力，均衡兒童所需營養，增強兒童體質。本實驗觀察了兒童口服液對小鼠免疫功能的影響，現將實驗結果報道如下。

1 材料

1.1 受試藥物

兒童口服液，由無限極（中國）有限公司提供，批號：12J16A01A-A；茯苓多糖口服液，湖南補天藥業有限公司，批號：20120602。

1.2 主要試劑、儀器

環磷酰胺，山西普德藥業股份有限公司，批號：04120704；DNCB，廣州齊云生物科技有限公司，批號：0168B383；丙酮，天津大茂化學試劑廠，批號：20110414；蓖麻油，天津市耀華化學試劑有限責任公司，20100205；RPMI1640培養液，Thermo，批號：NXJ0699；小牛血清，GIBCO，批號：8122818；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，EL204；恒溫水浴箱，上海精宏實驗設備有限公司，DK-420S；全波長酶標儀，Thermo Fisher Scientif i c Oy，1510。

1.3 動物

KM小鼠，SPF級，合格證號：SCXK（粵）2008-0020，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 對免疫器官重量的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續30 d。正常對照組和模型組給予等容積蒸餾水。于實驗前5 d，除正常對照組外，其余各組腹腔注射環磷酰胺（50 mg/kg/日），連續3 d。末次給予受試樣品1 h后，脫頸椎處死小鼠，取胸腺和脾臟精密稱重，計算臟器系數。

2.2 溶血素抗體含量測定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續30 d。正常對照組和模型對照組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，除正常空白對照組外均腹腔注射環磷酰胺（50 mg/kg/日），連續3 d。試驗第24 d，各組腹腔注射綿羊紅細胞（0.2 mL/只），免疫6 d后，眼眶取血，分離血清進行溶血素含量的測定。

綿羊紅細胞（SRBC）的制備：兩倍體積液阿氏液（Alsever）與一倍體積綿羊紅細胞混勻，置于4℃冰箱中保存備用。臨用時取上述保存的綿羊紅細胞，用生理鹽水洗滌3次，每次2000 rpm，5 min，棄上清液，再用生理鹽水3:5稀釋。

補體制備：取豚鼠8只，心臟采血，離心分離血清，-20℃保存，臨用時生理鹽水1:10稀釋。

溶血素測定：取小鼠血清，用生理鹽水500倍稀釋。各組樣品管中分別加入1:500小鼠血清1 mL、1:10補體血清1 mL、以及稀釋10%SRBC 0.5 mL混勻，另取空白管，分別加入等量的補體、SRBC及1 mL生理鹽水。然后各管于37℃水浴鍋中水浴10 min后，冰浴10 min終止反應，2000 rpm離心10 min，取上清液，以空白管調零，在可見光分光光度計540 nm處測定各管OD值。記錄結果，進行統計學處理。

2.3 對遲發超敏反應的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續30 d。空白對照組和模型組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，每只小鼠腹部去毛，范圍約3 cm×3 cm，將含5%DNCB的丙酮麻油溶液(1:1,V/V)50 μL均勻涂抹致敏，次日強化1次；小鼠致敏后立即腹腔注射環磷酰胺125 mg.kg-1誘導小鼠降低的DTH反應。致敏5 d后，用5%DNCB丙酮麻油溶液10 μL均勻涂抹于各組小鼠右耳內外兩面進行攻擊，左耳涂抹等量無DNCB的丙酮麻油溶液。攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，于耳片外側2/3部分用打孔器取下直徑8 mm的耳片，置電子天平稱重，以左右耳片重量之差作為腫脹度。記錄結果并進行統計學處理。

2.4 對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續30 d。正常對照組和模型對照組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，除正常對照組外，其余各組腹腔注射環磷酰胺（50 mg/kg/日），連續3 d。末次給予受試樣品1 h后，由小鼠尾靜脈注入50%印度墨汁生理鹽水溶液（0.1 mL/10g），在注入墨汁后30 s及6 min從小鼠眼眶取血，用移液槍取25 μL，立刻吹入2 mL Na2CO3（0.1%）溶液中，于該溶液中吸入、吹出數次以充分洗出吸管壁附著之血液。再取25 μL空白小鼠血置于2 mL0.1% Na2CO3溶液中作為校準，于可見分光光度計675 nm處測定吸光度。脫頸椎處死小鼠，取肝臟和脾臟精密稱重，按下式計算吞噬指數K、吞噬系數（校正吞噬指數）α。記錄結果，并進行統計學處理。

（式中C為血中碳粒濃度即吸光度；T為時間（min）；W為體重（g）；WLS為肝脾合重（g））

2.5 NK細胞活性測定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續30 d。正常對照組給予等容積蒸餾水。末次給予受試樣品1 h后處死動物，取脾進行實驗。①小鼠脾細胞懸液的制備方法同前，細胞濃度為5×106個/mL。②靶細胞：傳代培養的L929細胞在實驗前一天換液，實驗時用0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化1～2 min，加完全1640培養液，輕輕吹打細胞使其完全從壁上脫落，1000 rpm離心5 min，傾去上清液，將沉積細胞重懸于含10%小牛血清1640培養液中，調細胞濃度至1×105個/mL即為備用的靶細胞。③NK細胞活性的測定：向96孔平底塑料培養板每孔中分別加入靶細胞懸液（0.1 ml/孔）,然后放入37℃、5%二氧化碳培養箱內培養4 h，使靶細胞貼壁成一單層細胞，實驗組每孔加入0.1 mL效應細胞(使效靶細胞比例為50:1)，每樣品做3個復孔，靶細胞對照孔加1640培養液0.1 mL，再放置于37℃、5%二氧化碳培養箱內培養20 h，傾去上清液，用生理鹽水輕輕灌滿各孔，以除去效應細胞及被殺傷而脫落下來的靶細胞，重復3次，在濾紙上吸干孔內水分，每孔加入0.1 mL中性紅染液（0.1%），37℃培養30 min，棄去染液，再用生理鹽水洗3次后，每孔加入0.1 mL細胞溶解液（醋酸：乙醇=1:1)，使吞有中性紅的靶細胞溶解，釋放出中性紅，輕輕震蕩使分散搖勻。用酶標儀在492 nm處測定OD值。按照如下公式計算殺傷率即為NK細胞活性。結果進行統計學處理。

2. 6 統計方法

所有實驗數據均以x±S表示。計量數據采用SPSS 17. 0 統計軟件進行方差分析及組間檢驗。P < 0. 05有統計學意義。

3 結果

3.1 兒童口服液對小鼠免疫器官重量的影響

表1 兒童口服液對免疫器官重量的影響（x±S）

3.2 兒童口服液對小鼠血清溶血素含量的影響

表2 兒童口服液對溶血素抗體含量的影響（x±S）

3.3 兒童口服液對小鼠遲發超敏反應的影響

表3 兒童口服液對環磷酰胺降低小鼠DTH反應的影響（x±S）

3.4 兒童口服液對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

表4 兒童口服液對單核-巨噬細胞功能的影響（x±S）

3.5 兒童口服液對小鼠NK細胞活性的影響

表5 受試品對NK細胞活性的影響（x±S）

4 討論

胸腺和脾臟都是重要的免疫器官，其中胸腺是T細胞分化、成熟的場所，其功能狀態直接決定機體的細胞免疫水平，并間接影響體液免疫功能。脾臟是免疫細胞定居的場所，也是免疫應答的場所，可以制造免疫球蛋白、補體等免疫物質，發揮免疫作用[1]。體液免疫是機體特異性免疫的重要組成部分，負責體液免疫的細胞是B細胞。B淋巴細胞在抗原刺激及Th細胞輔助下，最終分化成能產生抗體的漿細胞。抗體形成細胞數量的多少可反映機體體液免疫的水平[2]。遲發型變態反應是由于機體T2淋巴細胞受抗原刺激后，分化為特異性的致敏T2淋巴細胞，當致敏T2淋巴細胞再次接觸相同的抗原后，引起遲發型超敏反應，使T2淋巴細胞活化，釋放出多種淋巴因子，產生炎癥，炎癥反應的程度反映了機體對該抗原特異性細胞免疫力的大小[3]。單核巨噬細胞系統在機體的特異性和非特異性免疫中亦發揮重要作用，如直接吞噬、殺傷病原體和腫瘤細胞，產生免疫調節因子等，顯示出非特異性免疫作用[4]。NK細胞是一類重要的免疫調節細胞，是機體細胞免疫功能的組成部分，NK細胞能非特異性地殺傷靶細胞（主要是某些腫瘤細胞和病毒感染細胞），因此，NK細胞在腫瘤免疫、抗病毒感染中具有重要作用，已公認其在免疫監視中為最重要的效應細胞[5]。

本實驗的結果表明，兒童口服液可顯著升高免疫功能低下小鼠的脾臟系數、胸腺系數, 增加血清中溶血素抗體的含量，提高免疫抑制小鼠遲發超敏反應強度，增加單核-巨噬細胞的吞噬能力，提高小鼠NK細胞的活性，提示兒童口服液能夠提高機體免疫功能。

[1] 沈關心.微生物與免疫學[M].北京:人民衛生出版社,2003:17.

[2] 李儀奎. 中藥藥理實驗方法學(第二版)[M].上海:上海科學技術出版社,2006:159.

[3] 徐叔云.藥理試驗方法學(第三版)[M].北京:人民衛生出版社,2001:1420.

[4] 劉藝萍.巨噬細胞的抗腫瘤效應[J].國外醫學?免疫學分冊,1998, 21(4): 207.

[5] 王蒙.自然殺傷細胞的抗病毒活性[J].免疫學雜志, 2003,19(2):154.