放射性肺損傷大鼠的數字化基因表達譜分析

劉 欣，王炳勝，劉秀芳

數字化基因表達譜(digital gene expression profile)是利用新一代高通量測序和高性能的計算機分析技術，全面、經濟、快速地檢測某一特定組織在特定狀態下的基因表達情況，這一技術已被廣泛應用于疾病發病機制研究、藥物研發等領域。放射性肺損傷是指胸部腫瘤患者在接受放射治療的過程中，正常肺組織因受到一定劑量放射線的照射而造成的不同程度的損傷，臨床表現為早期急性放射性肺炎和晚期肺纖維化，發生率為 16．3%～50．7%［1］，嚴重影響患者的生活質量。放射性肺炎常發生在放療結束后1～3個月，臨床表現為發熱、干咳、少痰、胸悶、胸痛等。嚴重者表現為高熱、劇烈咳嗽、咯血痰、呼吸困難，不能平臥，甚至發生急性呼吸衰竭而導致病人死亡。放射性肺纖維化多發生于治療結束后3～6個月，表現為慢性呼吸衰竭等一系列相應癥狀和體征。放射性肺損傷一旦發展到纖維化階段，幾乎不可逆轉，是限制放療療效的一個重要因素。多數學者認為放射性肺損傷的發生和腫瘤壞死因子、白介素等細胞因子級聯反應有密切的關系［2］，但其分子生物學機制尚未明確。本實驗通過小劑量多次照射大鼠制造放射性肺損傷模型，用數字化基因表達譜分析放射性肺損傷發生時肺組織的差異表達基因，以尋找放射性肺損傷發生過程中的關鍵基因，為臨床靶向治療提供新的思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性成年Wistar大鼠20只，體質量(200±20)g，合格證號:0172808。購自華阜康生物科技股份有限公司，分籠飼養。在SPF級實驗室正常飼養3 d，無異常者入組實驗。將20只實驗大鼠隨機分為單純照射組(模型組)10只、空白對照組(對照組)10只。

1.2 主要試劑及儀器 Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Illumina測序芯片，Illumina Cluster Station和Illumina HiSeqTM2000系統均購于Illumina公司;6MV-X線直線加速器購于上海高科技放療設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物造模:模型組均采用6MV-X直線加速器照射右肺，照射前均使用0.4%戊巴比妥鈉10 ml/kg腹腔麻醉，俯臥于平臺，模擬機下定位，鉛塊遮擋左肺及縱隔，照射野面積3 cm×3 cm，每次5 Gy，每周1次，總劑量30 Gy。對照組只進行麻醉，不予照射。

1.3.2 取材:于首次照射模型大鼠開始計時，兩組均于第6、12周末各隨機抽取5只大鼠，用0.4%戊巴比妥鈉10 ml/kg腹腔麻醉后立即開胸取右肺組織，保存于－80℃冰箱備用。

1.3.3 數字化基因表達譜信息分析流程

1.3.3.1 Tag的制備:提取 6 μl總 mRNA，利用Oligo(dT)磁珠吸附純化mRNA，并以Oligo(dT)引導反轉錄合成雙鏈cDNA。采用四堿基識別酶NlaⅢ，識別并切斷cDNA上的CATG位點，利用磁珠沉淀純化帶有cDNA 3＇端的片段，將其5＇末端連接Illumina接頭1。利用MmeI酶切CATG位點下游17 bp處，通過磁珠沉淀去除3＇片段后，在Tag 3＇末端連接Illumina接頭2，從而獲得兩端連有不同接頭序列的21 bp標簽library。經過15個循環的PCR線性擴增后，通過6%TBE PAGE膠電泳純化95堿基條帶，解鏈后，單鏈分子被加到Illumina測序芯片上并固定，每條分子經過原位擴增成為一個單分子簇測序模板，加入4色熒光標記的4種核苷酸，采用邊合成邊測序法測序。測序得到的原始圖像數據通過熒光信號讀取堿基的方法轉化為序列數據，稱為原始Tag。

1.3.3.2 Tag的純化:原始序列帶有一段3＇adaptor序列，并且含有少量低質量序列以及各種雜質成分。經過一系列數據處理，得到純化的Tag。

1.3.3.3 基因表達的注釋:經過測序質量評估、測序飽和度分析、實驗重復性分析、純化Tag拷貝數分布統計、純化Tag比對統計等一系列處理后對基因表達進行注釋［3］。

1.3.3.4 差異基因的篩選:參照Audic等［4］的數字化基因表達譜差異基因檢測方法，開發了嚴格的算法篩選兩樣本間的差異表達基因。在本研究中，差異表達基因定義為假陽性率≤0．005且差異倍數在2倍以上(即Log2Ratio≥1)的基因。

1.3.3.5 確定差異表達基因行使的主要生物學功能:通過基因本體(gene ontology，GO)功能顯著性富集分析、差異基因表達模式聚類分析等一系列后續處理后得出結果，確定差異表達基因行使的主要生物學功能。

2 結果

第6周末，模型組相比對照組的差異表達基因有1050個，其中上調基因為669個，下調基因為381個;根據特定規則找出顯著富集的GO條目，發現這些基因主要和細胞代謝過程相關。通過差異基因表達模式聚類分析顯示，上調基因主要與DNA鏈斷裂、細胞凋亡、特異性炎癥有關，下調基因主要與DNA/RNA合成代謝、細胞分裂有關，篩選出的差異表達基因見表1。

第12周末，模型組相比對照組的差異表達基因有2050個，其中上調基因為833個，下調基因有1271個。找出顯著富集的GO條目，發現這些基因主要和應激反應、免疫過程有關。差異基因表達模式聚類分析結果顯示，上調基因主要與炎癥因子、細胞凋亡、DNA損傷修復、纖維化相關，下調基因主要與DNA/RNA合成代謝、細胞分裂有關。篩選出的差異表達基因見表2。

表1 實驗大鼠第6周末模型組對比對照組差異表達基因

表2 實驗大鼠第12周末模型組對比對照組差異表達基因

3 討論

放射性肺損傷主要分為早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，早期放射性肺炎主要發生于放療后的1～3個月，放射性肺纖維化主要發生于放療后的3～6個月［5-8］。本實驗采用小劑量分次照射大鼠右肺，類似于臨床胸部腫瘤患者的放療方式，檢測時間定在照射開始后第6、12周末，可分別觀察早期放射性肺炎及晚期放射性肺纖維化發生初期時的差異表達基因。

DNA是電離輻射主要的靶分子之一，在細胞輻射損傷中發揮重要的作用。DNA鏈斷裂是細胞輻射損傷的重要形式，DNA雙鏈斷裂可造成細胞致死性損傷［3］。研究表明，即使是低劑量的X射線也能激發細胞的損傷修復機制［9］。本研究顯示，在照射后第6、12周末時均有DNA鏈斷裂、細胞凋亡等相關基因高表達，DNA/RNA合成代謝、細胞分裂等相關基因低表達，且在12周末時這些基因差異表達更明顯。表明放射性肺損傷造成細胞DNA鏈斷裂，并因此使細胞凋亡增多，DNA合成、細胞分裂等活動減少。因在第12周末時肺損傷較嚴重，故這些基因差異表達更明顯。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組金屬依賴性蛋白酶，能特異性的降解細胞外基質，并可以被組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)特異性抑制。MMPs/TIMPs是影響細胞外基質降解最主要的一組酶系，兩者的平衡在多種疾病的發生發展中都起到重要作用［10］。生理狀態下細胞外基質處于不斷產生和不斷降解的動態平衡中，細胞外基質成分過度沉積是肺纖維化形成的關鍵，而膠原蛋白、纖維素連接蛋白及層粘連蛋白均是細胞外基質的重要成分。因此，MMPs/TIMPs及膠原蛋白、纖維連接素、層黏連蛋白均與肺纖維化的形成有密切關系。本研究模型組對比對照組在第 6、12周末均有 MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1的高表達，且各基因在 12周末時差異表達更明顯，而12周末模型組膠原蛋白、層黏連蛋白及纖維素連接蛋白等纖維化相關基因明 顯 高 表 達，提 示 MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1參與了放射性肺損傷的形成，且在放射性肺損傷的不同時期差異基因表達不同。Araya等［11］通過體外培養人支氣管上皮細胞株，照射后發現MMP-2表達增高;Susskind等［12］報道了肺癌、乳腺癌患者放療后血漿中 MMP-9升高;Lee等［13］發現放射線可以導致MMP-2/TIMP-1平衡的改變，從而使Ⅳ型膠原蛋白降解減少，細胞外基質沉積。MMP-12大多由巨噬細胞產生，主要作用于彈性蛋白，在肺纖維化形成過程中起重要作用［14］。Manetti等［15］證明MMP-12在系統性硬化病患者中血漿水平增高，并與其肺纖維化及血管損傷嚴重程度相關。李新春等［16］發現放射線照射后 MMP-12酶活性增高，并可能通過降解基底膜彈力纖維促進成纖維細胞轉化，啟動肺纖維化的發生。本研究亦發現在篩選出的差異表達基因中，MMP12差異表達更顯著，提示MMP12或可能是放射性肺損傷發生的關鍵基因。MMP-14是一個有效的細胞外基質降解酶，它可以水解多種細胞外及細胞膜相關物質蛋白，其表達水平與腫瘤轉移密切相關［17］。但近年來并未有MMP-14與放射性肺損傷相關的報道。本研究中MMP14在放射性肺損傷早期及晚期均有明顯高表達，提示MMP14在放射性肺損傷發生過程中發揮重要作用，或可能是放射性肺損傷的又一敏感基因。

綜上所述，本研究用數字化基因表達譜分析了放射性肺損傷發生過程中的差異基因表達，了解到在放射性肺損傷形成的不同時期差異基因表達不同，MMP2、MMP9、MMP12、TIMP1 參與了放射性肺損傷的形成，并可能在激活炎癥因子方面起到重要作用。MMP2、MMP9、MMP12、MMP14、TIMP1 均為放射性肺損傷的敏感基因，但其與放射性肺損傷發生的具體關系不是十分清楚，有待進一步研究;MMP12或可能是放射性肺損傷形成的關鍵基因，MMP14或可能是放射性肺損傷的又一敏感基因。

［1］ 張英杰，李建彬，田世禹，等．肺癌放療所致放射性肺損傷的相關因素分析［J］．中華腫瘤防治雜志，2008，15(16):1264-1267．

［2］ Arpin D，Perol D，Blay J Y，et al．Early variations of circulating interleukin-6 and interleukin-10 levels during thorscic radiotherray are predictive for radiation pneumonitis［J］．J Clin Oncol，2005，23(34):8748-8756．

［3］ Sutherland B M，Georgakilas A G，Bennett P V，et al．Quanitifying clustered DNA damage induction and repair by gel electrophoresis，electronic imaging and number average length analysis［J］．Mutat Res，2003，531(1-2):93-107．

［4］ Audic S，Claverie J M．The significance of digigal gene expression profiles［J］．Genome Res，1997，7(10):986-995．

［5］ 張曉敏，王炳勝，葛艷麗，等．益氣活血中藥治療放射性肺損傷臨床療效觀察［J］．中國綜合臨床，2011，27(9):908-910．

［6］ 接亞敏，韓北秋，喬文波，等．放射性肺損傷相關臨床因素的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2011，18(15):1201-1203．

［7］ 王曉萍，張道富，張新良，等．漢防己甲素防治放射性肺損傷的臨床觀察［J］．中華腫瘤防治雜志，2010，17(18):1457-1459．

［8］ 曹小飛，官健，陳龍華，等．放射性肺損傷大鼠肺組織Bcl-2和Bax表達變化及其意義的探討［J］．中華腫瘤防治雜志，2010，17(16):1249-1252．

［9］ Staaf E，Brehwens K，Haghdoost S，et al．Gamma-H2AX foci in cells exposed to a mixed beam of X-rays and alpha particles［J］．Genome Integr，2012，3(1):8．

［10］ Amalinei C，Caruntu I D，Giusca S E．Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions［J］．Rom J Morphol Embryol，2010，51(2):215-228．

［11］ Araya J，Maruyama M，Sassa K，et al．Ionizingradiationenhaneesmatrix metalloproteinase-2 produetion in human lung epithelial cells［J］．Am TPhysiol Lung Cell Mol-Physiol，2001，280(1):30-38．

［12］ Susskind H，Hymowitz M H，Lau Y H，et al．Inereased Plasma levels of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in lung and breast eaneerarealtered during chest radiotherapy［J］．Int J Radiation Oncology BiolPhy，2003，56(4):1161-1169．

［13］ Lee W H，Warrington J P，Sonntag W E，et al．Irradiation alters MMP-2/TIMP-2 system and collagen typeⅣdegradation in br［J］．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，82(5):1559-1566．

［14］ Matute Bello G，Wurfel M M，Lee J S，et al．Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37(2):210-221．

［15］ Manetti M，Guiducci S，Romano E，et al．Increased serumlevels and tissue expression of matrix metalloproteinase-12 in patients with systemic sclerosis:correlation with severity of skin and pulmonary fibrosis and vascular damage［J］．Ann Rheum Dis，2012，71(6):1064-1072．

［16］ 李新春，宋良文，楊蕾蕾，等．MMP-12異常表達對放射性肺損傷大鼠肺內成纖維細胞轉化的影響［J］．解放軍醫學雜志，2009，34(3):267-270．

［17］ Bodnar M，Szylberg L，Kazmierczak W，et al．Differentiated expression of membrane type metalloproteinases(MMP-14，MMP-15)and pro-MMP2 in laryngeal squamous cell carcinoma．A novel mechanism［J］．J Oral Pathol Med，2012，23(8):231-234．