小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子對(duì)其促增殖作用的研究

段朝霞，陳魁君，張潔元，李兵倉(cāng)，王建民

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)由一層扁平細(xì)胞所組成，呈單層連續(xù)性襯在血管內(nèi)面，形成血管的內(nèi)壁。在炎癥反應(yīng)、損傷及免疫應(yīng)答等多種病理生理過程中發(fā)揮作用。VEC功能的異常與血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病、免疫疾病及腫瘤擴(kuò)散都有密切關(guān)系［1］。為了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能有更多了解，研究者不斷地對(duì)人及動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行探索。本文參照文獻(xiàn)報(bào)道的培養(yǎng)方法［2-3］，探索簡(jiǎn)單易行的小鼠VEC的培養(yǎng)及鑒定方法，并研究巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)對(duì)VEC增殖活性的影響，為深入研究VEC的相關(guān)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)6～8周齡C57B6小鼠5只，雌雄不限，體質(zhì)量18～25 g。由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為 Gibco產(chǎn)品，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)為 Sigma公司產(chǎn)品，大鼠抗小鼠 CD31/CD144抗體為BD公司產(chǎn)品，基質(zhì)膠(MatrigelMatrix)購(gòu)于BD公司，大鼠抗小鼠CD146免疫磁珠、MPC-S型磁架為Dynal公司產(chǎn)品，胰酶為Invitrogen產(chǎn)品，小鼠重組 MIF及抑制劑［(S，R)-3-4-羥苯-4，5-二氫-5-異口惡唑乙酸甲酯］(ISO-1)為 Sigma公司產(chǎn)品，甲基噻唑基四唑(MTT)試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。倒置相差顯微鏡(Olympus)、熒光顯微鏡(Leica)、酶標(biāo)儀(Thermo labsysytems)。

1.3 方法

1.3.1 抗體磁珠的預(yù)處理:首先將50 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于50 ml磷酸緩沖液(PBS)中制成0.1%BSA/PBS的磁珠沖洗緩沖液，用0．22 μm 濾器無菌處理后4℃保存;在超凈工作臺(tái)內(nèi)取100 μl抗CD146免疫磁珠于1 ml磁珠沖洗緩沖液，置于磁架上，1 min后移去上清液，重復(fù)沖洗4次;用磁珠沖洗緩沖液再懸浮磁珠至最初的容積，每100 μl磁珠加入10 μl(5 μg)抗體，置于旋轉(zhuǎn)混勻機(jī)混勻，4℃孵育過夜或室溫孵育2 h;于磁架上用磁珠沖洗緩沖液沖洗4次后，再用磁珠沖洗緩沖液再懸浮磁珠抗體至最初的容積，于4℃條件下可保存1個(gè)月。

1.3.2 細(xì)胞的制備:實(shí)驗(yàn)前1天將基質(zhì)膠放入4℃條件下過夜，使其溶化;加入血管環(huán)之前15 min，在12孔板內(nèi)加入1．0 ml基質(zhì)膠(保證底部鋪滿即可)，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)使其凝固。用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉小鼠后，用75%乙醇消毒5 min，無菌條件下打開腹腔和胸腔，游離主動(dòng)脈，取髂總動(dòng)脈分支平面到降主動(dòng)脈段的動(dòng)脈，置于裝有冰D-Hanks液的一次性組織培養(yǎng)皿內(nèi)，用無菌注射器吸取D-Hanks液沖洗血管環(huán);然后將血管環(huán)移入另一個(gè)裝有冰D-Hanks液的一次性組織培養(yǎng)皿內(nèi)，在解剖顯微鏡下剝?nèi)パ墉h(huán)周圍的脂肪及結(jié)締組織;再將分離的組織置于直徑100 mm的一次性組織培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下將血管環(huán)剪成0．5 mm長(zhǎng)短后放入預(yù)先加了基質(zhì)膠的12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔放2或3節(jié)，孔內(nèi)再加基質(zhì)膠，覆蓋血管環(huán)，放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)15 min使其凝固，在培養(yǎng)孔內(nèi)加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(含 20%FBS、75 μg/ml ECGS，50 μg/ml肝素、200 U/ml青霉素、0．2 μg/ml鏈霉素的DMEM)。將培養(yǎng)板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，采用胰酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 單細(xì)胞懸液的制備:細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)進(jìn)行胰酶消化收集細(xì)胞。吸掉培養(yǎng)基，以少許0．25%胰酶溶液潤(rùn)洗1遍，吸掉潤(rùn)洗液，加入0.25%胰酶溶液，完全蓋住細(xì)胞即可，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化并計(jì)時(shí)，相差顯微鏡下觀察消化狀態(tài)，以細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間有明顯間隙為消化完全，輕輕拍打培養(yǎng)皿邊沿使細(xì)胞分散開，立即加入3～4 ml含血清的培養(yǎng)液終止消化，混勻制成單細(xì)胞懸液，備純化用。

1.3.4 免疫磁珠的分離:嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。每1 ml細(xì)胞懸液加入15 μl抗CD146免疫磁珠，置于旋轉(zhuǎn)混勻機(jī)4℃孵育20 min;將EP管置于磁架2 min。吸附細(xì)胞的磁珠和無細(xì)胞吸附的磁珠將被分至EP管的兩極;無需移動(dòng)EP管，將上清液移出，從磁架上取下EP管，各加入1 ml冰基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸磁珠團(tuán)粒;將EP管再置于磁架上2 min，小心地吸出上清;重復(fù)沖洗至少4次，直至上清液變得清澈;各加入1 ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)重懸磁珠團(tuán)粒，收集純化細(xì)胞計(jì)數(shù)并鑒定純度，然后將其余細(xì)胞按104接種至0．1%明膠涂層的96孔板或10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量的完全培養(yǎng)基;放入5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，移除未貼壁細(xì)胞，已貼壁細(xì)胞用D-Hanks液沖洗2次后加入適量完全培養(yǎng)基;隔日換液。

1.3.5 細(xì)胞的鑒定:采用抗CD31抗體進(jìn)行VEC的免疫組化鑒定，同時(shí)用Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核。用摔片機(jī)將經(jīng)抗CD146免疫磁珠純化后的細(xì)胞集中在玻片上，每張玻片約1000個(gè)細(xì)胞，然后將細(xì)胞標(biāo)本用新鮮配制的4%多聚甲醛固定10 min;PBS漂洗3次，每次5 min;用山羊血清或1%BSA室溫下孵育30～60 min;加入大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜或37℃孵育3 h，PBS漂洗3次，每次5 min;加入PE標(biāo)記的山兔抗大鼠IgG(1∶50)二抗混合工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;5 μg/ml的 Hoechst 33342工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;玻片自然干后，用封片劑封片，防止熒光淬滅;在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇9個(gè)視野，相應(yīng)激發(fā)光下分別觀察CD31抗體及Hoechst 33342染色結(jié)果。

1.3.6 細(xì)胞增殖的測(cè)定:用MTT試劑盒檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。將細(xì)胞按104/孔種植于96孔板，待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)按是否加入不同濃度的MIF或MIF拮抗劑ISO-1，分為空白對(duì)照組(8孔)、MIF組(40孔)、ISO-1組(24孔)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μl MTT試劑，輕輕混合均勻后，將培養(yǎng)板放于37℃條件下孵育3 h，孵育結(jié)束后，96孔板底部可見黑色顆粒狀物質(zhì);輕輕吸掉上層液體，注意不要將黑色顆粒吸出;每孔加入100 μl顆粒溶解液，混勻后成用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)吸光度(OD)值。MIF 用 5、25、50、100、200 ng/ml 5 個(gè)濃度，ISO-1 用100、250、500 μmol/L 3 個(gè)梯度，每個(gè)濃度用8孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，α=0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 VEC形態(tài) 原代培養(yǎng)4～6 d，在動(dòng)脈血管環(huán)附近可見少量的細(xì)胞遷出并貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈短梭形或多角形，細(xì)胞邊界清楚，體積較大，胞漿豐富，核呈橢圓形。培養(yǎng)9～14 d，遷移出的細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)孔面積的2/3以上，密度不勻，其中約80%的細(xì)胞匯合成多層，單層呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的“鵝卵石”樣特征。見圖1。

圖1 原代培養(yǎng)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鏡下形態(tài)(×100)

2.2 細(xì)胞鑒定 純化細(xì)胞經(jīng)免疫組化后在熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞純度均在95%以上，見圖2。由于未經(jīng)過培養(yǎng)的細(xì)胞直接用摔片機(jī)摔到玻片上的，因此免疫組化結(jié)果顯示無明顯的細(xì)胞形態(tài)。

圖2 熒光顯微鏡下小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞CD31(免疫熒光染色 ×100)

2.3 MIF對(duì)VEC增殖的影響 低劑量MIF能顯著促進(jìn)VEC的增殖，并具有劑量效應(yīng)關(guān)系，而高劑量MIF及MIF的抑制劑ISO-1能顯著抑制VEC的增殖，ISO-1的抑制增殖作用也具有劑量效應(yīng)關(guān)系。見表1。

表1 不同濃度MIF及ISO-1促進(jìn)主動(dòng)脈VEC增殖的情況

3 討論

國(guó)內(nèi)外開展VEC的原代培養(yǎng)已多年，方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法;鑒定方法多用細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫組化染色AgⅧ相關(guān)抗原、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31表達(dá)等［4-7］。上述2種VEC原代培養(yǎng)方法雖然步驟簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)易行，但是存在成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞干擾的缺點(diǎn)，即便使用差速貼壁和分次消化的方法也不能完全去除雜細(xì)胞，從而使其實(shí)用性受限。本實(shí)驗(yàn)選擇酶消化法結(jié)合免疫磁珠法分選，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的條件，反復(fù)摸索，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的VEC培養(yǎng)方法上加以改進(jìn)，可快速、簡(jiǎn)便地分離、純化、體外培養(yǎng)和鑒定小鼠VEC。結(jié)果顯示，成功分離并體外擴(kuò)增出小鼠VEC，克服了雜細(xì)胞的干擾。實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵在于:抗體磁珠預(yù)處理時(shí)充分清洗(不少于4次)，盡量去除疊氮鈉(NaN3)以減少其對(duì)細(xì)胞的不良影響;取動(dòng)脈環(huán)及分離時(shí)盡量在冰DHanks液中操作，以保證細(xì)胞的活性;胰酶消化時(shí)，最好每隔幾分鐘放于顯微鏡下觀察一次，完全消化后及時(shí)終止消化，一般總消化時(shí)間不能超過20 min，以免損傷細(xì)胞影響貼壁;抗體與磁珠作用及細(xì)胞與抗體磁珠作用時(shí)保持4℃環(huán)境，以確保抗體活性，并降低細(xì)胞代謝，從而保證分選效率和細(xì)胞活性。

MIF從被發(fā)現(xiàn)至今已40多年，研究者對(duì)它的認(rèn)識(shí)逐漸全面、深刻。MIF作為淋巴細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)并一度被認(rèn)為只有活化的T淋巴細(xì)胞才能產(chǎn)生MIF，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)腦垂體前葉、單核(巨噬)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、VEC和平滑肌細(xì)胞等也產(chǎn)生MIF［8］。MIF除作為淋巴細(xì)胞因子外，還是一種重要的促炎因子，能夠?qū)固瞧べ|(zhì)激素的抗炎作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，是參與腫瘤形成和血管發(fā)生的重要因子［9-11］。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，天然MIF和重組MIF同樣具有互變異構(gòu)酶的活性。ISO-1為選擇性MIF互變異構(gòu)酶抑制劑的一種，通過特異性結(jié)合MIF的D型多巴色素互變異構(gòu)酶活性位點(diǎn)，抑制該酶活性并阻止MIF結(jié)合其他細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，從而抑制MIF的功能活性［12］。大量研究證實(shí)，MIF能促進(jìn)多種細(xì)胞如大腸癌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞等的增殖;而MIF的抑制劑ISO-1可抑制這些細(xì)胞的增殖及相應(yīng)的功能活性［13-16］。本研究初步證實(shí)，低劑量MIF可以促進(jìn)VEC增殖，并具有劑量效應(yīng)關(guān)系。高濃度MIF卻不具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，反而抑制細(xì)胞的增殖，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果不一致。筆者查閱大量的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)很少的文獻(xiàn)做MIF促細(xì)胞增殖的量效關(guān)系研究，大多數(shù)直接采用低濃度(10 ng/ml)的MIF做增殖實(shí)驗(yàn)。有研究證實(shí)，MIF在50～100 ng/ml時(shí)的活性達(dá)到最佳［17］，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致高濃度MIF抑制細(xì)胞增殖的原因有待于進(jìn)一步明確。

本研究結(jié)果初步證實(shí)，低濃度的MIF能促進(jìn)原代培養(yǎng)的VEC增殖，說明MIF在血管發(fā)生及其他血管類病變中起重要作用，也可能通過促進(jìn)血管生成來加強(qiáng)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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