外源性甲胎蛋白對甲胎蛋白表達缺失HepG2細胞系增殖與凋亡的影響*

冉 云 鄧 欣 楊大國△ 吳其愷 陳文林 陶艷艷

1.湖北中醫藥大學2010級博士研究生班 (湖北武漢，430065) 2.深圳市第三人民醫院肝病科 3.上海中醫藥大學肝病研究所

在前期研究中，我們應用RNAi(RNA干擾)技術構建了AFP siRNA-HepG2細胞系［1］，現在我們擬應用不同濃度外源性AFP刺激此細胞，觀察細胞增殖和凋亡的情況，AFP對此細胞系的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細胞:AFP siRNA-HepG2細胞系，以含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養，胰蛋白酶消化傳代。②受試藥物:AFP純蛋白，購自Meridian公司 (A32260)。③主要試劑:DMEM、胎牛血清均購自Gibco公司;胰蛋白酶購自羅氏 (中國)有限公司;噻唑藍(MTT)，購自 Sigma公司;Dimethylsulfoxide(DMSO)，購自Amresco公司;Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡試劑盒，購自BD公司。

1.2 MTT方法檢測細胞增殖 細胞以濃度1×106個/ml，100μl接種96孔板，待細胞貼壁后將細胞分為6組，對照組加入含0.5%FBS的DMEM培養液，其他5組分別加入含100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml AFP 的0.5%FBS的DMEM培養液，每組設6個復孔，培養24小時后，吸盡培養液，每孔加入MTT(終濃度為0.5mg/ml)37℃孵育4小時，小心吸棄培養液，每孔加入150μl DMSO溶液，待充分溶解后微孔板分光光度計測定吸光值OD490。

1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞以濃度1×106個/ml，1ml接種6孔板，待細胞貼壁后將細胞分為6組，對照組加入含0.5%FBS的DMEM培養液，其他5組分別加入含100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml AFP 的 0.5%FBS的DMEM培養液，每組設3個復孔，培養24小時后收集上清液，無EDTA胰酶消化，中止消化后輕輕吹打使細胞從培養皿上脫落，收集細胞，200目濾網過濾細胞。設陰性及單染細胞，1 000rpm/min，離心5分鐘，PBS兩次重懸細胞，離心后小心吸棄上清液，1×結合液100μl重懸細胞，AnnexinV陽性對照組及實驗組加入5μl AnnexinV，7AAD陽性對照組及實驗組加入5μl 7AAD，輕輕混勻后室溫避光孵育15分鐘，1×結合液稀釋后置冰盒避光，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1不同濃度AFP對細胞增殖的影響 MTT比色法的檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，分光光度計測定吸光值OD490，OD可反映活細胞數量。MTT結晶形成的量與活細胞數成正比。本實驗MTT結果提示，100μg/ml AFP顯著抑制細胞增殖 (P＜0.01)，低于100μg/ml AFP促進細胞增殖 (P＜0.05)。見表1。

表1 不同濃度AFP對細胞增殖的影響(±s)

表1 不同濃度AFP對細胞增殖的影響(±s)

與對照組比較，*P＜0.01，#P＜0.05

組別 OD值0.625±0.015 100μg/ml AFP組 0.407±0.011*10μg/ml AFP組 0.752±0.010*1μg/ml AFP組 0.771±0.009*0.1μg/ml AFP組 0.776±0.011*0.01μg/ml AFP組 0.723±0.022對照組#

2.2 不同濃度AFP對細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測細胞凋亡，Q2、Q3兩個象限為凋亡細胞百分比。本實驗結果提示，100μg/ml AFP組凋亡細胞為25.53%，與對照組比較，有明顯誘導細胞凋亡的作用 (P＜0.01)，10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml 4組濃度AFP對細胞凋亡無影響 (P＞0.05)。見表2、圖1。

表2 不同濃度AFP對細胞凋亡的影響(±s，%)

表2 不同濃度AFP對細胞凋亡的影響(±s，%)

與對照組比較，*P＜0.01

組別不同象限凋亡細胞率Q2 Q3 2.52±0.21 0.45±0.18 100μg/ml AFP組 20.25±1.26* 5.28±0.28*10μg/ml AFP組 3.20±0.21 0.62±0.11 1μg/ml AFP組 2.34±0.27 0.51±0.10 0.1μg/ml AFP組 2.36±0.45 0.38±0.08 0.01μg/ml AFP 組對照組3.08±0.53 0.42±0.10

圖1 不同濃度AFP對細胞凋亡的影響

3 討論

AFP(Alpha fetoprotein)作為原發性肝癌標志物，是診斷原發性肝癌的重要實驗室指標，并常作為治療肝癌的有效性驗證指標。AFP在肝癌的發生、發展中的作用及機制受到很多學者的關注。有文獻報道，AFP對腫瘤細胞增殖有雙向調節作用，大劑量外源性AFP(＞100μg/ml)抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，小劑量AFP(＜100μg/ml)促進腫瘤細胞增殖［2～4］。本實驗應用RNAi技術構建的不表達甲胎蛋白的AFP siRNA-HepG2細胞系，觀察外源性AFP對AFP siRNAHepG2細胞系增殖和凋亡的影響，結果提示，＞100μg/ml外源性AFP抑制AFP siRNA-HepG2細胞增殖并誘導細胞凋亡，＜100μg/ml AFP促進細胞增殖，對細胞凋亡無影響。既往報道與本研究結果一致，但既往研究采用的是表達AFP的HepG2細胞，本研究應用不表達AFP的AFP siRNA-HepG2細胞進行實驗，除去了HepG2細胞不斷自分泌AFP對細胞的影響。本實驗研究結果亦說明我們可以來用AFP siRNA-HepG2細胞系進行一系列藥物治療肝癌的作用機理研究。

［1］冉云，鄧欣，楊大國，等.AFP表達缺失人肝癌HepG2細胞株的構建［J］.中西醫結合肝病雜志，2011，21(5):282－283.

［2］ URIEL J.The physiological role of alpha-fetoprotein in cell growth and differentiation ［J］ .Nucl.Med.Allied Sci，1989，33(3 Suppl):12－17.

［3］ ELENA DUDICH，LYDIA SEMENKOVA，ELENA GORBATOVA，et al.Growth-Regulative Activity of Human Alpha-Fetoprotein for Different Types of Tumor and Normal Cells ［J］ .Tumor Biology，1998，19(1):30－40.

［4］ WANG XW，XU B.Stimulation of tumor-cell growth by alpha-fetoprotein ［J］.Int J Cancer，1998，75(4):596－599.