蒲公英抗氧化活性部位研究1）

戎晉華，趙文英＊，黃巧燕，李學強

（1.青島科技大學化工學院，山東 青島266042；2.青島市海泊河污水處理廠）

蒲公英為菊科蒲公英屬植物，是臨床上常用的中藥材，具有很多的藥理作用，主要包括抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等作用，是有非常好的開發前景的可以藥食同用的中草藥。蒲公英含有多種有效成分，如黃酮類、倍半萜內酯類、酚酸類、蒲公英甾醇、揮發油類等［1］，這些成分大多具有較強的抗氧化活性。目前人們對其各類成分的提取研究報道較多，因其有“天然抗生素”之美稱，對其活性研究主要集中在抑菌活性方面，而對其他作用報道較少，尤其是抗氧化活性的研究目前尚少見報道。大量研究證實，中草藥能延緩衰老與治療疾病大多與其抗氧化作用密切相關。本試驗采用傳統水提法來提取蒲公英，然后將提取液用不同極性的有機溶劑分層萃取，并研究各層提取物的抗氧化活性，為進一步研究蒲公英中抗氧化活性成分提供依據，為蒲公英的開發應用積累有價值的資料。

FRAP法［2］、超氧陰離子清除率法和DPPH法這三種方法廣泛應用于各種天然提取物抗氧化活性的測定，是較簡便快捷的測抗氧化能力的方法。FRAP法測定總抗氧化能力，測量的是酸性條件下抗氧化物將Fe3＋還原成Fe2＋的能力。超氧陰離子清除率法是根據抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除能力對其抗氧化性能進行評價。DPPH法是根據抗氧化劑清除DPPH·自由基的能力測得抗氧化劑的活性。DPPH·不能與只含有一個－OH的芳香酸反應，也不能與B－環上沒有－OH的類黃酮反應。利用這三種方法全面衡量蒲公英的抗氧化活性，為蒲公英的抗氧化活性研究及天然藥物的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

M297714型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；DZKW－4型電子恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；KH－250DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀有限公司；RE－52型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB－Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；GZX－9070MBE型電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LG－04A型四兩裝高速中藥粉碎機，瑞安市百信藥機器械廠；UV762型紫外／可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

蒲公英，購于本地德全堂大藥店；三氯化鋁標準品，山東威世達實業有限公司；DPPH標準品，美國sigma公司；TPTZ標準品，美國sigma公司；FRAP工作液（由25mL 300mmol／L pH3.6的醋酸鹽緩沖液、2.5mL 10mmol／L TPTZ 溶 液、2.5mL 20mmol／L FeCl3溶液混合而成）。其它試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 傳統水提法

稱取50g蒲公英藥材，加入約500mL蒸餾水（料液比為1∶10），加熱至煮沸提取30min，提取3次，合并三次提取液，濃縮至約800mL。用75%乙醇多次醇沉多糖，取上清液。

將提取液用多層紗布過濾3次，收集澄清的黃色濾液約300mL，置于500mL的分液漏斗中，加入100mL石油醚進行溶劑萃取，收集上層溶液，同法萃取三次，合并上層石油醚萃取液。再用相同方法依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，收集下層水層。

分別將各層提取液置于旋轉蒸發儀中旋轉蒸發，收集各層提取物，水浴鍋上干燥，稱量，保存。

1.2.2 蒲公英的抗氧化活性實驗

1.2.2.1 FRAP法總抗氧化力測定

標準曲線的繪制：分別吸取不同濃度的FeSO4標準液0.1mL，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去離子水，混勻，準確反應5min，于593 nm處測定其吸光度，用去離子水調零，作標準曲線，得回歸方程：y＝0.1761x－0.0757，R2＝0.9995，在0.15～0.90mmol／L范圍內線性關系良好。樣品的抗氧化能力以FRAP值表示［3］：1FRAP單位＝1mmol／L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當于FeSO4的mmol／L數。

稱取各層提取物適量，配制成一定濃度的溶液，分別量取0.1mL溶液，加入3.0mL FRAP工作液，再加入0.3mL去離子水，混勻，準確反應5 min，于593nm處測定其吸光度，用去離子水調零。

1.2.2.2 超氧陰離子清除作用［4］

稱取各層提取物適量，配制成一定濃度的溶液，取0.05mol／L，pH為8.2的Tris·HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25℃水浴中預熱20min，加入不同溶劑提取的蒲公英提取液0.1mL，2.5mol／L鄰苯三酚0.4mL，混勻后在25℃水浴中反應4min，立即用10mol／L HCl兩滴終止反應，并在299nm處測定吸光度（用蒸餾水調零），空白組的0.1mL去離子水代替樣品，并按下式計算清除率：

清除率＝（1－A試樣／A空白）×100%；

1.2.2.3 DPPH·自由基清除能力［5］

配制5×10－5mol／L的DPPH·溶液。分別取各層提取物0.01g與50mL甲醇配成0.2g／mL的溶液。取各溶液1.5mL與甲醇2.5mL配成溶液，再取各溶液1.5mL與DPPH溶液2.5mL配成溶液，最后取DPPH溶液2.5mL與甲醇1.5mL配成溶液，充分震蕩后黑暗下室溫放置，30min后測定混合溶液在517nm處的吸光度。利用DPPH溶液的特征紫紅色基團的吸收，用紫外－可見分光光度法測定反應后的提取物溶液在517nm吸收的下降程度表示其對有機自由基的清除能力。

試樣提取液對DPPH·自由基的清除率可用下式計算：

P＝［1－（Ai－Aj）／Ac］×100%

其中，Ai＝2.5mL DPPH溶液＋1.5mL待測溶液吸光度；Aj＝1.5mL待測溶液＋2.5mL溶劑的吸光度；Ac＝2.5 mL DPPH＋1.5mL溶劑的吸光度。

2 結果與討論

2.1 蒲公英的提取

由上表得，各層提取物的質量分布趨勢：水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞石油醚層。提取液中水層質量最多，且遠遠大于其他三層，而其他三層質量相差較少。水層為極性成分，正丁醇層和乙酸乙酯層為中極性成分，石油醚層為非極性成分，說明蒲公英中成分質量分布為強極性成分＞中極性成分＞非極性成分，極性成分相對較多。

2.2 蒲公英的抗氧化活性

圖2 各層提取物對超氧陰離子清除率

圖3 各層提取物對DPPH·自由基的清除率

由以上數據得，3種方法所得結果基本一致，各層提取物均具有超氧陰離子和DPPH·自由基清除作用，均具有抗氧化活性，蒲公英中含有很多抗氧化成分，黃酮類物質是主要的天然抗氧化劑［6］，它具有活潑的酚羥基，在遇到活性氧自由基時，易失去酚羥基上的氫，具有直接清除或淬滅·、·OH、H2O2等活性氧、自由基的作用［7］。蒲公英提取物包括黃酮和其它含酚羥基的化合物，在這個過程中可能起著互補或者協同的作用。

三種方法各層提取物的抗氧化能力均為：正丁醇層＞乙酸乙酯層＞水層＞石油醚層。石油醚萃取的是非極性成分，如脂質、揮發油、游離甾體及三萜類化合物等，乙酸乙酯主要萃取出游離生物堿、有機酸、黃酮、香豆素苷元等中等極性的物質，在乙酸乙酯后用正丁醇萃取，正丁醇相中一般來說是中等極性中極性相對較大的成分，含苷類成分比較多。也就是說，乙酸乙酯層中可能主要含有黃酮類、香豆素類和酚酸類等抗氧化活性較強的成分，正丁醇中可能含有黃酮苷等抗氧化活性較強的成分，水層含有的蛋白質和多糖也有一定的抗氧化活性，石油醚中含有的倍半萜內酯類及植物甾醇等也有抗氧化活性。

但3種方法所得結果也有所差異，FRAP法中水層和石油醚層抗氧化活性相當，超氧陰離子清除率法中水層和乙酸乙酯層抗氧化活性接近，DPPH法中正丁醇層和乙酸乙酯層抗氧化活性基本相同，其他則相差較多；而超氧陰離子清除率法和DPPH法都用清除率表示，但二者所得的清除率相差很多，這說明這3種方法是從不同層面對抗氧化活性進行評價，能全面反應蒲公英的抗氧化活性。

提取物雖然水層質量較多，但抗氧化活性較弱，因此水層通常視為雜質，不予研究。而活性最強的是正丁醇層和乙酸乙酯層，說明蒲公英中具有抗氧化活性的成分大多數是中極性的，且是極性中極性偏大的，少數是極性的和非極性的。這可能是由于蒲公英中主要的抗氧化活性成分［8］既有以苷元形式存在，又有以苷的形式存在的，分別被乙酸乙酯和正丁醇萃取。具體這兩層中含有哪些成分，還需進一步研究。

3 結論

文中采用FRAP法抗氧化活性實驗、超氧陰離子清除率抗氧化活性實驗和DPPH·自由基清除能力抗氧化活性實驗這3種方法來檢測蒲公英各層提取物的抗氧化活性，結果可以看出，3種方法得各層提取物的抗氧化活性都是正丁醇層＞乙酸乙酯層＞水層＞石油醚層。

實驗將蒲公英提取液用極性不同的3種有機溶劑分別萃取，即將提取液中各成分按極性不同分開，然后研究各部分的抗氧化活性，從而找到抗氧化活性最強的成分，為蒲公英有效成分的純化分離提供依據，有助于進一步研究蒲公英的成分，可以更好地促進蒲公英的抗氧化活性在醫藥及保健等領域的開發、應用。蒲公英作為一種資源廣、提取方便、抗氧化作用顯著的藥用資源，用來研究開發具有抗氧化功能的化妝品、保健品和藥物具有廣闊的應用前景。

［1］ 金善花，全光石.中藥材抗氧化劑的研究概況和發展趨勢［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（12）：157－160.

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