人AQP5真核表達質粒的構建及其在胃癌細胞中的表達

黃永紅，徐方云，呂農華

（1.南昌大學第一附屬醫院消化內科，南昌 330006；2.南昌大學基礎醫學院病理生理教研室，南昌 330006）

水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）是跨膜水通道蛋白家族的重要成員之一，廣泛分布于分泌性腺體上皮組織和細胞，在體內水平衡和腺體分泌等方面起著重要作用［1］。新近研究表明，AQP5在多種腫瘤組織細胞中呈異常表達，可能通過調節腫瘤細胞的增殖與轉化［2］、影響腫瘤細胞的侵襲與遷移等參與腫瘤的發生與發展［3］。因此，AQP5正成為腫瘤研究的新領域。本研究運用分子生物學方法，構建人AQP5重組質粒并將其導入人胃癌細胞株AGS細胞中，從而獲得穩定表達AQP5基因的AGS細胞系，為進一步研究AQP5基因對胃癌惡性表型的影響奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株AGS為本研究所保種；pcDNA 3.1／myc-His質粒為本院科研中心羅時文教授饋贈；總RNA提取液（TRIzol）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒為北京TransGen公司產品；脂質體Lipofectmine2000試劑為美國Invitrogen公司產品；限制性核酸內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶為日本TaKaRa公司產品；質粒小提試劑盒及膠回收試劑盒為Omega公司產品；兔抗人AQP5抗體為Abcam公司產品；鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體為Santa Cruze公司產品；遺傳霉素（G418）為 Merck公司產品；美國Invitrogen公司完成引物合成；北京諾賽基因公司完成基因測序。

1.2 方法

1.2.1 人AQP5真核表達質粒的構建 根據序列數據庫GenBank中人AQP5的mRNA序列設計特異性引物。引物序列：上游5′-GCGAT GAA GAA GGA GGT GTG CTC CGT-3′（BamHⅠ）；下游5′-CCGTCA GCG GGT GGT CAG CTC C-3′（EcoRⅠ），下劃線示酶切位點（BamHⅠ、EcoRⅠ）。用PCR法擴增獲得AQP5目的片段，產物長度為810bp。對擴增的AQP5基因片段和載體pcDNA3.1／myc-His分別用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳（110V，35min），電泳片段用凝膠回收試劑盒回收。AQP5目的片段與線性載體分別按摩爾比3∶1、6∶1和9∶1用T4DNA連接酶進行連接，4℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞后，接種于含氨芐西林100μg／mL的Lu-ria-Bertani（LB）固體培養基平板，37℃篩選過夜。挑取陽性克隆搖菌提取質粒，質粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定。將酶切鑒定正確的陽性質粒送北京諾賽基因公司進行測序鑒定。

1.2.2 細胞培養及質粒轉染 轉染前24h取對數生長期AGS細胞，調整細胞密度為1×105／mL，接種于12孔培養板，次日進行轉染。隨機分為對照組、空載體組和AQP5轉染組。轉染前棄含血清雙抗培養基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗2遍后，每孔加無血清無雙抗Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）1mL，將質粒（μg）和Lipofectmine 2 000（μL）按1∶3的比例分別用100μL無血清培養基稀釋，各自輕輕混勻靜置5min后，再混合兩者靜置20min，將混合液均勻加至相應的細胞中，于37℃CO2孵育箱中培養5h后更換10%胎牛血清含青鏈雙抗的DMEM培養基繼續培養。

1.2.3 G418篩選濃度的確定及AGS細胞陽性克隆的篩選將AGS細胞以5×104／mL密度接種于12孔培養板中，24h后，將G418與含血清的DMEM培養基混合，配成濃度分別為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和 1 000mg／L 的液體，每隔3d換液一次，培養10d，以10d90%細胞致死量為最佳篩選濃度，因此確定400mg／L為最佳篩選濃度。轉染24 h后按1∶10傳代于24孔板，細胞貼壁后加入含400mg／L G418的完全培養基培養14d至篩選出陽性克隆；挑取陽性克隆繼續擴大培養，篩選出的穩定細胞株分別命名為AGS／AQP5細胞（轉染AQP5的細胞）和AGS／EV細胞（轉染空載體的細胞），用200mg／L G418維持培養。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞AQP5mRNA表達 TRIzol法抽提AGS（對照組）、AGS／AQP5（AQP5 組）和 AGS／EV（空載組）細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄獲取cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。AQP5引物序列：上游5′-CTT CCT CAA GGC CGT GTT C-3′；下游 5′-CTC CTC CCA GTC CTC GTC A-3′；內參β-actin引物序列：上游 5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′；下游5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′。反應條件94℃預變性4min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環，72℃繼續延伸7min。取10μL PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析進行分析，以目的條帶AQP5與β-actin灰度值的比值反映AQP5mRNA相對表達水平。實驗重復至少3次。1.2.5 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測細胞AQP5蛋白表達 收集對照組、AQP5組和空載組細胞，細胞裂解液提取總蛋白。BCA法進行蛋白含量測定。取總蛋白50μg／孔在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）40V，30 min后改電壓為80V，120min后至溴酚藍跑至膠最下方取膠，將分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，25V90min進行轉膜。轉膜后5%脫脂奶粉含0.1%葉吐溫20Tris緩沖溶液（TBST）4℃封閉60min；加入一抗孵育（AQP5 1∶500，β-actin 1∶500）4℃過夜，TBST洗膜3次，10min／次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（1∶5 000）孵育，4℃5h，洗膜，曝光、顯影、定影。Gel-pro凝膠成像分析軟件分析AQP5蛋白和β-actin蛋白的灰度值，并計算其比值反映AQP5蛋白相對表達水平。實驗重復至少3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據以表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 克隆的雙酶切及序列測定 重組質粒雙酶切后瓊脂糖電泳約在810bp和5 480bp附近分別見一明顯條帶，與目的片段大小相符，見圖1，北京諾賽基因公司測序結果與GenBank中人AQP5（NM＿001651.2）的核苷酸序列完全一致。

圖1 酶切鑒定電泳圖

圖2 RT-PCR檢測各組AGS細胞AQP5mRNA的表達

圖3 Western Blot檢測各組AGS細胞AQP5蛋白的表達

2.2 AQP5mRNA的表達 外源AQP5轉染AGS細胞后，AQP5mRNA表達水平顯著上調，AQP5組與對照組、空載組比較，AQP5mRNA水平顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05），而對照組與空載組比較mRNA表達差異無統計學意義（P=0.355），見圖2。

2.3 AQP5蛋白的表達 外源AQP5轉染AGS細胞后，AQP5蛋白表達水平顯著上調，AQP5組與對照組、空載組比較，AQP5蛋白水平顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.05），而對照組與空載組比較蛋白表達差異無統計學意義（P=0.181），見圖3。

3 討 論

水的微環境是細胞內外一切生命活動進行的場所，腫瘤的發生、發展也離不開水的微環境。而且，腫瘤細胞為了滿足快速增殖、分裂及向周圍基質侵襲和轉移的需要，一系列酶的活性和表達發生改變，細胞基本結構成分合成明顯加強；同時癌細胞向周圍基質侵襲和進出血管／淋巴管時需要體積和外形發生相應改變［4］。因此，腫瘤細胞比正常細胞更需要水分子的快速跨膜轉運。

近年文獻報道AQP5蛋白過度表達于多種腫瘤組織中［5-8］，并與某些腫瘤的進展、化療藥物的耐受及患者的預后相關。體外實驗表明，AQP5參與腫瘤生物學行為的形成。Chae等［9］發現過表達AQP5的K562細胞和LAMA84細胞增殖能力增強。Chen等［10］采用RNA干擾（RNAi）技術沉默 AQP5基因表達可明顯減少人肺癌細胞株SPC-A1細胞的遷移和侵襲能力，且認為其遷移和侵襲能力下降與沉默AQP5基因，降低細胞水的通透性，調節細胞大小和形態有關。Jung等［11］在乳腺癌研究中亦發現乳腺癌細胞MCF7AQP5表達與腫瘤細胞的增殖和轉移能力相關。Chae等［7］的研究表明，外源性表達AQP5的正常肺上皮細胞株BEAS-2B可發生上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT），細胞呈成纖維樣改變，失去細胞-細胞間連接和細胞極性，而且細胞上皮標志蛋白表達下調、間質標志蛋白表達則上調，提示AQP5可通過EMT促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。此外，動物實驗表明AQP5過表達可誘導荷瘤動物腫瘤發生轉移［12］。目前病理組織學研究發現［13-14］，正常胃黏膜組織中AQP5呈低表達，而胃癌組織中AQP5呈高表達，提示AQP5可能參與胃癌的發生與發展。但是，AQP5基因在胃癌發生發展中究竟發揮何種作用，有待深入研究。

總之，本研究通過Western Blot和RT-PCR實驗證實已成功篩選出穩定表達外源性人AQP5基因的AGS胃癌細胞株，這為進一步研究AQP5基因在胃癌發生發展中可能扮演的角色奠定實驗基礎。

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