辛伐他汀對(duì)ApoA5表達(dá)的影響＊

李全忠，王楊陽(yáng)，陽(yáng)躍忠，夏中華，孫 婧

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西桂林 541001）

血脂的高低與冠心病的發(fā)生率和死亡率直接相關(guān)。血漿高密度脂蛋白（HDL）水平與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。血漿三酰甘油（TG）濃度升高也被證實(shí)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。目前臨床上應(yīng)特別重視血漿總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，同時(shí)也應(yīng)關(guān)注高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）低下和TG升高。

載脂蛋白A5（apolipoprotein A5，ApoA5）是迄今為止第一個(gè)過(guò)度表達(dá)引起血漿TG下降的載脂蛋白。與相同劑量的洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀等其他β-羥-β-甲戊二酸單酰輔酶a（HMG-CoA）還原酶抑制劑相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的TC和LDL-C［2］。除此之外，辛伐他汀升高HDLC及降低TG的總有效率分別為48.1%及58.2%［3］。結(jié)合ApoA5與HDL-C正相關(guān)且血清中TG增高和ApoA5下降有一定關(guān)系的研究結(jié)果，推測(cè)辛伐他汀可能通過(guò)影響ApoA5的表達(dá)從而起到升高HDL-C及降低TG的作用。作者以人肝癌細(xì)胞株 G2（human hepatic cancer cell line G2，HepG2）為模型，觀察辛伐他汀對(duì)ApoA5的影響，從而更好地闡述辛伐他汀對(duì)血脂代謝影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞：HepG2由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供；（2）試劑：辛伐他汀原藥粉、兔抗人載脂蛋白A5抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒購(gòu)自上海易利生物科技有限公司；（3）主要儀器：CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Precision公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇蘇凈集團(tuán)安康公司，德國(guó)Eppendof冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，北京六一電泳儀購(gòu)自北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司，ABI9700基因擴(kuò)增儀購(gòu)自上海天呈科技有限公司，達(dá)暉DHB-30恒溫金屬浴購(gòu)自廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEN（含12%胎牛血清、100μg／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素）。細(xì)胞種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱，每隔2d換液一次，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)后將其接種到6孔培養(yǎng)板（接種細(xì)胞濃度為1×105個(gè)／孔，每孔3mL培養(yǎng)液），待細(xì)胞融合生長(zhǎng)到50%～70%。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細(xì)胞2次，然后加入含有不同濃度（0、1、5、10、25、50μmol／L）辛伐他汀的DMEM，3毫升／孔，于37℃培養(yǎng)48h。收集 HepG2細(xì)胞，分別吸取每孔培養(yǎng)液平均分配至兩個(gè)1.5mL離心管中，凍存于-20℃。吸棄剩余的培養(yǎng)液。然后每孔加入細(xì)胞裂解液500μL，室溫放置5min后轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，凍存于-80℃，備用。

1.3 PCR檢測(cè) 根據(jù)Trizol總RNA提取試劑盒中的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞內(nèi)RNA，合成cDNA，然后用ABI9700基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增cDNA，ApoA5與作為內(nèi)參的磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物序列為。ApoA5引物序列：上游5′-AGC AGA TAA TGG CAA GCA TGG CTG C-3′；下 游 5′-GCA GCC ATG CTT GCC ATT ATC TGC T-3′。產(chǎn)物大小為280bp。為保證各RNA樣本量的均一性，采用GAPDH作為內(nèi)參。GAPDH引物序列：上游5′-AAC GTG TCA GTG GTG GAC CT-3′；下游5′-AGG GGA GAT TCA GTG TGG TG-3′。產(chǎn)物大小為400bp。PCR產(chǎn)物加載藥緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠100V電泳30min。用捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行灰度掃描，目的基因mRNA表達(dá)量用每例標(biāo)本目的基因的平均灰度值／同一標(biāo)本GAPDH的平均灰度值來(lái)表示。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè) 在收集好的細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃冰浴10min，15 000r／min離心5min，棄除沉淀，二辛可酸（BCA）法蛋白定量。取50μg蛋白加入2倍濃度十二烷基磺酸鈉（SDS）凝膠加樣緩沖液中，100℃水浴10min，立刻置于冰上備用。6%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)PDVF膜。置膜于5%脫脂奶粉。封閉緩沖液1h，室溫緩慢搖動(dòng)，按1∶500加入ApoA5一抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)，1倍濃度洗滌緩沖液（TBST）洗膜5次，每次5 min。按1∶4 000加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（HRP）的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)，1倍濃度TBST洗膜5次，每次5min。在暗室中與化學(xué)發(fā)光劑免疫印跡化學(xué)發(fā)光（ECL）反應(yīng)，X線膠片曝光顯影，觀察分析。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對(duì)HepG2細(xì)胞ApoA5mRNA表達(dá)的影響各組 ApoA5分別為對(duì)照組0.222±0.022、1μmol／L組0.348±0.031、5μmol／L 組 0.42±0.027、10μmol／L 組0.47±0.025、25μmol／L 組 0.61±0.013、50μmol／L 組0.56±0.022。與對(duì)照組比較，不同濃度的辛伐他汀（1、5、10、25μmol／L）組ApoA5mRNA均顯著上調(diào)，并且升高程度隨辛伐他汀干預(yù)濃度的增加而增加（P＜0.05）。各組間兩兩比較，其水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。至濃度為50μmol／L時(shí)，辛伐他汀對(duì)ApoA5mRNA上調(diào)作用較25μmol／L組反而有所下降，這說(shuō)明辛伐他汀對(duì)ApoA5mRNA的上調(diào)作用呈劑量依賴性，但卻有最高上限濃度。見(jiàn)圖1。

2.2 辛伐他汀對(duì)HepG2細(xì)胞ApoA5蛋白表達(dá)的影響Western Blot檢測(cè)ApoA5蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，不同濃度的辛伐他汀（1、5、10、25μmol／L）組 ApoA5蛋白表達(dá)亦顯著上調(diào)，并且升高程度隨辛伐他汀干預(yù)濃度的增加而增加（P＜0.05）；各組間兩兩比較，其水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)辛伐他汀濃度達(dá)50μmol／L時(shí)，辛伐他汀對(duì)ApoA5 mRNA上調(diào)作用較25μmol／L組反而有所下降，與PCR所得結(jié)果一致，再次證明辛伐他汀對(duì)ApoA5mRNA的上調(diào)作用呈劑量依賴性，但卻有最高上限濃度這一觀點(diǎn)。見(jiàn)圖2、3。

圖1 不同濃度的辛伐他汀作用后，用PCR法擴(kuò)增的ApoA5mRNA及GAPDH的表達(dá)

圖2 不同濃度辛伐他汀作用后，Western Blot檢測(cè)ApoA5蛋白及GAPDH表達(dá)

圖3 不同濃度辛伐他汀作用后，檢測(cè)的各組ApoA5蛋白相對(duì)IOD值

3 討 論

冠心病由于其發(fā)生率、死亡率均很高，一直是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前研究認(rèn)為，冠心病的發(fā)生、發(fā)展與多種遺傳和環(huán)境因素有關(guān)［4］。而血脂異常是冠心病的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在形成動(dòng)脈粥樣硬化的各因素中，血脂代謝異常起著重要的作用，除高TC血癥外，血清TG濃度升高在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的作用也逐漸得到肯定，HDL則是冠心病的保護(hù)因子，HDL-C代表HDL中膽固醇的含量，在血脂中起的作用是參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)錄，是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護(hù)因子。當(dāng)HDL-C含量過(guò)低時(shí)，即使TC在合適水平，也會(huì)顯著增加冠心病的危險(xiǎn)。

Pennacchio等［5］和van der Vliet等［6］通過(guò)比較小鼠與人的基因組DNA發(fā)現(xiàn)了一種新的載脂蛋白基因——ApoA5，它與已知的ApoA1／C3／A4基因簇相距約30kb。基因全長(zhǎng)1 889bp，由4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，編碼366個(gè)氨基酸［7］，主要分布在極低密度脂蛋白（VLDL）、HDL和乳糜微粒中［8］。它能與血漿脂質(zhì)結(jié)合，構(gòu)成脂蛋白的主要成分，是決定脂蛋白結(jié)構(gòu)、功能和代謝的核心組分，其結(jié)構(gòu)和合成異常將影響血脂代謝。有學(xué)者推測(cè)ApoA5可能具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能［9］，能清除組織中的脂質(zhì)和抗動(dòng)脈粥樣硬化。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ApoA5主要影響血漿TG代謝，ApoA5基因變異與血漿TG水平增高及家族性混合型高脂血癥有關(guān)，血漿ApoA5濃度與TG濃度呈負(fù)相關(guān)，提示ApoA5有降TG的作用。帶ApoA5腺病毒載體小鼠的血漿TG和TC濃度分別降低了70%和40%，原因是ApoA5過(guò)度表達(dá)后極大地降低了VLDL的比例，從而降低TG水平，也使脂蛋白中的膽固醇減少，其中HDL中的膽固醇降低幅度最大，從而使血漿TC濃度降低［10］。在老年人群中，血清ApoA5水平與血清TG水平呈顯著負(fù)相關(guān)，這也支持ApoA5是TG代謝的一個(gè)重要決定因素［11］。何成毓等［12］和Grosskopf等［13］的研究均顯示，ApoA5與TG呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)，多元回歸分析顯示，TG、HDL與ApoA5有關(guān)。

辛伐他汀不僅可以有效地降低血清中的TC和LDL-C，而且也有增高HDL-C及降低TG的作用，曾群英等［14］在一項(xiàng)關(guān)于辛伐他汀治療69歲以上老年高脂血癥患者的安全性及臨床療效的報(bào)道中指出，辛伐他汀治療24周后TC、TG、LDL-C均較治療前明顯下降（P＜0.01），HDL-C則較治療前顯著上升（P＜0.01），與安慰劑比較，辛伐他汀顯著降低TC、TG、LDL-C（P＜0.01），顯著升高 HDL-C水平（P＜0.01）。

李琰［15］調(diào)查78例患者經(jīng)16周口服辛伐他汀治療后，與治療前相比，TG、TC、LDL-C值均顯著下降（P＜0.05），HDLC值顯著上升（P＜0.05）。

在本實(shí)驗(yàn)中，作者以不同濃度的辛伐他汀（1、5、10、25、50 μmol／L）作用于 HepG2細(xì)胞，體外培養(yǎng)48h后，以PCR和Western Blot法，于基因水平及蛋白水平分別檢測(cè)ApoA5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著辛伐他汀濃度的增加（1、5、10、25、50μmol／L），ApoA5的表達(dá)明顯增加，通過(guò)單因素方差分析檢驗(yàn)，各組間水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通過(guò)實(shí)驗(yàn)所得IOD值，可以直觀地看到當(dāng)辛伐他汀達(dá)到一定濃度時(shí)（50μmol／L），載脂蛋白的表達(dá)量反而較前一組（25μmol／L）有所下降，推測(cè)辛伐他汀上ApoA5的表達(dá)有一定的濃度上限，兩種方法測(cè)量所得結(jié)果一致。由此推測(cè)辛伐他汀可通過(guò)上調(diào)ApoA5而達(dá)到影響血脂水平的作用，這為進(jìn)一步研究辛伐他汀的調(diào)脂機(jī)制提供又一新的思路，并為其提供一定的理論基礎(chǔ)。

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