吲哚青綠介導光動力療法治療兔眼后發性白內障中視網膜的毒性觀察＊

梁毓琳，李 蘭△，張遠平，李云川，查 旭，戴紅梅，曹 倩，李靜華，楊文艷

（1.云南省昆明市第一人民醫院眼科 650034；2.昆明醫科大學附屬第二醫院眼科，昆明 650000）

吲哚青綠染料（indocyanine green，ICG）是一種水溶性無毒三碳菁燃料，曾廣泛應用于眼科各類疾病的檢查診斷中。近年來，由于后發性白內障已成為影響白內障患者術后擁有良好視力的主要因素，在研究后發障的實驗中，ICG被作為一種光敏劑使用，并于動物實驗及體外實驗中取得了較好的治療效果。Melendez的體外實驗證實，ICG對晶狀體上皮細胞具有光動力毒性，并呈劑量依賴性。在近幾年對白內障術后的后發障治療中，寄予了吲哚青綠更多的期望并加強了對其臨床及基礎方面的研究。本研究在利用ICG介導光動力治療后發障實驗中，通過透射電鏡觀察視網膜有無損傷，了解在ICG介導激光治療后發障實驗中后對視網膜有無不良反應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只新西蘭兔，雌雄兼備，體質量2.0～2.5 kg，隨機分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 記錄儀器 重慶艾爾曦醫療器械設備有限公司生產的IVE 205A電生理檢查儀。

1.2.2 刺激參數 采用全視野閃光刺激器，白光刺激，刺激強度為1.6cd·m-2·s-1。

1.2.3 實驗步驟 分組后的新西蘭兔，行晶狀體超聲乳化手術，術前房內注入0.5mL濃度分別為1.25mg／mL（低劑量組），2.5mg／mL（中劑量組），5mg／mL（高劑量組）的ICG后分別注入氣體，使氣體泡與角膜內皮相接觸，隔離ICG與角膜內皮的接觸，用810nm的半導體激光對囊膜進行低能量（50 mW／cm）照射2min后完畢，沖洗出ICG，關閉切口。術后3個月，按晶狀體后囊增生混濁程度并分級，分級標準：按Odrich后囊膜混濁分級法（0級為透明；l級為輕度混濁，能看清眼底或混濁面積小于1／2后囊膜面積；2級為中度混濁，能模糊看見眼底或混濁面積大于1／2后囊膜面積；3級為完全混濁，不能看見眼底。

再對兔眼行閃光視覺誘發電位檢查。在視區皮層記錄到主要成分為NPN的3相波，其中，P波的出現率為100%，潛伏期最穩定，幅值也較高。故本試驗只測量P波的潛伏期、波幅、時程。檢查方法為均選取右眼電極，所有家兔均在清醒狀態下，充分散瞳中后于暗室內放置30min，支架固定頭部，室溫18～24℃。記錄電極刺于后枕區皮下，枕骨粗隆左右旁開0.5 cm處，參考電極刺于乳突處皮下，接地電極刺于鼻根處［1］。檢查結束后處死動物，取出眼球，制作透射電鏡視網膜標本。最后分別觀察不同組別兔眼視網膜損傷情況。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以表示，兔眼晶狀體后發障程度觀察結果采用χ2檢驗，兔眼閃光視覺誘發電位P波采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

術后3個月，各組兔眼晶狀體后發障程度觀察結果（χ2=122.49），差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 術后第3個月晶狀體后囊膜混濁情況（n=8）

圖1 視網膜電鏡圖片

經閃光視覺誘發電位檢測，實驗各組兔眼閃光視覺誘發電位P波經配對t檢驗潛伏期（t=0.374，r=0.033），波幅（t=2.187，r=0.251）、時程（t=1.766，r=0.566）與對照組比較均無較大差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組閃光視覺誘發電位的P波潛伏期、波幅、時程（，n=8）

表2 各組閃光視覺誘發電位的P波潛伏期、波幅、時程（，n=8）

組別 潛伏期 波幅 時程對照組113.37±15.25 8.85±1.90 68.58±7.99低劑量組 111.01±8.81 10.54±1.64 63.94±7.97中劑量組 105.13±14.22 9.60±1.57 60.01±8.59高劑量組110.64±12.33 9.75±2.31 63.07±5.39

視網膜透射電鏡檢查可見使用ICG各組兔眼視網膜結構均有不同程度損傷，以神經節細胞，膜盤水腫，以及線粒體損傷較明顯，其中低劑量組兔眼視網膜損傷相對較輕，雙極細胞與水平細胞胞質存在。RPE細胞層呈單細胞排列無水腫等改變，與視網膜神經層黏附良好，損傷層次局限于視錐細胞層。而中劑量組及高劑量組則可見視網膜全層均有不同程度損傷。對照組視網膜各層未見損傷，見圖1。

3 結 論

ICG原被用于視網膜和脈絡膜血管造影四十年，因其分子大，可與蛋白結合，對光敏感，吸收峰（805nm）與傳統半導體激光波長（810nm）相近，皮膚光毒性低，組織靶向性高，生物分布和清除迅速，使用操作簡單等特點使近年來其眼科用途逐漸擴大，已廣泛用于眼底視網膜手術中。但目前經臨床隨訪和實驗研究發現ICG在眼內使用，無論是單獨使用或聯合光照都具有潛在的神經毒性和視網膜毒性［2-3］。Rezai等［4］研究發現，ICG作用于RPE后明顯提高其凋亡率。Haritoglou等［5］對10例ICG染色后剝除的內界膜用透射電子顯微鏡進行分析顯示，視網膜內界膜面有Muller細胞的損傷和細胞破裂。推測與ICG屬于高分子物質，具有很強的親水性，溶解后包漿滲透提高，造成細胞水腫有關。王文瑩等［6］發現，ICG對體外培養RPE細胞生長有明顯抑制作用并呈濃度和時間依賴性。考慮為體內多種細胞可主動轉運攝取ICG，導致細胞內ICG濃度較高后細胞水腫。多項實驗證明了ICG長期存留對眼組織有潛在的危險［7］。國內何曉靜等［8］研究發現，經光動力治療后，細胞外節段排列輕微紊亂，RPE細胞輕微內質網擴張，其內可見髓樣小體。考慮機制為當激光作用于視網膜時，視網膜色素上皮的損傷，色素屏障受得破壞，結果提示能量能對光感受器和色素上皮起作用［9］。宋志杰等［10］在使用ICG染色視網膜內界膜治療黃斑裂孔時亦發現其藥物毒性與劑量呈相關，并隨隨訪時間的延長，視網膜水腫能夠逐漸減輕。李雁杰等［11］研究亦發現無論是低濃度還是高濃度的ICG直接用于都會對視網膜造成損傷。

本實驗中ICG雖不直接作用于眼底，但藥物滯留于后囊膜3個月，通過緩慢代謝，可能有部分ICG彌散到玻璃體腔及視網膜前造成損害，并可能隨濃度增加和作用時間延長，對細胞毒性作用逐漸增強。為了解ICG引導光動力治療后發障后是否也存在對視網膜細胞的毒性作用，從而更加全面評價本實驗的治療價值和不良反應，對不同藥物濃度組別分別觀察視網膜電鏡結果，同時行閃光視覺誘發電位檢查。本實驗設立了手術對照組，目的是為了了解手術是否會對視網膜造成損傷。手術對照組術后3個月電鏡顯示視網膜各層排列整齊、層次清晰，與正常兔眼視網膜電鏡圖片對比未見明顯結構改變。說明該手術對視網膜結構無明顯影響。

本實驗表明，利用ICG介導的光動力作用在治療兔眼后發障有效的同時，因ICG緩慢的彌散至玻璃體腔，不同濃度的ICG組均能對視網膜造成損傷，并呈劑量相關。低劑量組損傷較輕，高劑量組則損傷相對增多，在本實驗中以濃度為1.25 mg／mL ICG治療時損傷最少。結果與各類實驗中將ICG直接用于視網膜前結果類似。同時實驗各組未造成RPE的脫離及細胞凋亡，閃光視覺誘發電位與對照組P波潛伏期，波幅及時程比較均無明顯差異，且與正常兔眼閃光視覺誘發電位實驗值較為接近［12］。可考慮今后在進一步利用ICG介導光動力防治晶狀體后發障時，采用低濃度組治療，以在取得治療效果的同時將視網膜損傷降為最低。

［1］李超英，王良君，李臻.家兔視覺誘發電位正常值觀測［J］.青島醫學雜志，2005，37（3）：164-165.

［2］Dietz FB，JEaffe RA.Indocyanine green：evidence of neurotoxicity in spinal root axons［J］.Anesthesiology，2003，98（7）：516-520.

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［4］Rezai KA，Farrekh-Siar L，Ernest JT，et al.Lndecyanine green induces apoptosis in human retinal pigment epithe-lia 118［J］.Ophthalmol，2004，137（5）：931-933.

［5］Haritoglou C，Gandorfer A，Gass CA，et al.Indocyanine green-sisted peeling of the internal limitingmembme in macular holesurgery affects visual outcome：a elinicopathologic correlation［J］.Am J Ophthalmol，2002，134（6）：836-841.

［6］王文瑩，張皙.吲哚青綠對人視網膜色素上皮細胞和神經膠質細胞的影響［J］.眼科，2004，13（21）：47-51.

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［9］Peng C，Huang H，Shen XJ，et al.The effect of argon panretinal photoeoagulation for diabetic retinopathy［J］.Int J Ophthalmol，2007，7（3）：833-834.

［10］宋志杰，呂林.降低吲哚青綠著染內界面對黃斑區毒性的研究［J］.中國實用眼科雜志，2007，1（25）：105-107.

［11］李雁杰，成霄黎，王麗聰.玻璃體手術中吲哚青綠對視網膜結構的影響［J］.山西醫藥雜志，2007，11（36）：980-982.

［12］卜博，周定標，許百男.兔閃光刺激視覺誘發電位正常值測定［J］.中國臨床康復，2006，70（6）：46-47.