內毒素誘導D-半乳糖胺致敏大鼠急性肝損傷相關指標的動態觀察

陳 盛，何念海△，羅則佳

（1.第三軍醫大學西南醫院兒科，重慶 400038；2.成都軍區總醫院醫務部，成都 610083）

內毒素（endotoxin，ET）是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，又稱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。LPS血癥是嚴重創傷、感染、肝病以及眾多危重疾病的常見并發癥，它不僅可導致全身炎性反應綜合征（SIRS），嚴重者可導致多器官功能障礙綜合征（MODS）。肝臟是清除LPS的主要器官，也是LPS血癥時受損最早、最明顯的器官之一，兩者之間存在互為因果、相互影響的關系，一旦發生容易形成惡性循環［1］。本文建立了LPS誘導D-半乳糖胺（D-GalN）致敏大鼠急性肝損傷動物模型，動態觀察了肝損傷后大鼠肝臟病理、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的變化，以探討其在LPS急性肝損傷發生、發展中的規律及臨床意義，為尋求新的預防及治療方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，雌雄不限，10～12周齡，體質量180～220g在清潔級環境中適應1周后進入實驗，實驗前12h禁食，不禁水，實驗后即正常進食、進水。

1.1.2 主要試劑及材料 D-GalN購自重慶醫科大學生化室，LPS購自美國Sigma公司，Dab顯色試劑盒購自北京中山生物科技有限公司，原位末端標記法（TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司，大鼠TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢博士德公司，大鼠IL-1βELISA試劑盒購自北京北方偉業發展有限公司，光學顯微鏡（LEICA BF200型）德國萊卡公司產品，全自動生化分析儀（H-7110）日本日立公司產品。

1.2 方法

1.2.1 LPS誘導D-GalN致敏大鼠急性肝損傷動物模型的建立［2］。48只大鼠隨機分為模型組和對照組，每組各24只。所有模型組大鼠均以LPS（50μg／kg）＋D-GalN（300mg／kg）用1 mL無菌生理鹽水溶解后腹腔內注射，對照組大鼠僅腹腔內注射1mL生理鹽水。

1.2.2 標本收集 每組分別在注射后6、24、48h3個時間點隨機抽取8只大鼠，麻醉處死大鼠后取肝組織備送光鏡及TUNEL分析、采血查 ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-1β等。

1.2.3 光鏡觀察肝組織的病理變化 取右葉同一部位肝組織，置10%甲醛磷酸鹽緩沖液固定后，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2.4 血清ALT、AST、TBIL水平檢測 腹腔注射后6、24、48h時取對照組、模型組血液，4℃全能型高速冷凍離心機（3 000r／min）離心5min取上層血清。全自動生化析儀檢測ALT、AST、TBIL水平。

1.2.5 肝細胞的凋亡檢測 采用TUNEL檢測，肝組織經多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋、切片，切片常規脫蠟、水化后按照TUNEL試劑盒操作說明書步驟進行。最后常規行DSB染色。光鏡下觀察，凋亡細胞核呈棕褐色為陽性。計算凋亡指數（apoptosis index，AI）用以判斷肝臟損傷程度。不同的時間點每組取2張切片，每片隨機選5個高倍鏡視野，每個視野計數100個肝細胞核，計算凋亡細胞百分比的均數，即為凋亡指數。

1.2.6 血清TNF-α、IL-1β水平檢測 采用ELISA法，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理 用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料以表示，多組間的均數比較采用一元方差分析（One-Way ANOVA），均數之間的多重比較采用Scheffe方法（方差齊）或者Tamhane方法（方差不齊）進行，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠肝臟的病理學觀察

2.1.1 肉眼觀察肝臟大體形態學改變 對照組肝臟形態正常，被膜光滑，色澤紅潤，質地柔軟。模型組6h無明顯肉眼可見變化，24、48h肝臟光澤差，略顯蒼白，質地柔韌，未見明顯出血點。

2.1.2 肝臟組織形態學光鏡觀察 對照組肝臟的肝小葉組織結構完整，未見腫脹、變性、壞死（圖1A）。模型組6h可見肝細胞輕度變性、濁腫，未見壞死（圖1B）；24h時可見肝細胞廣泛濁腫，點灶狀壞死，炎癥細胞浸潤，中央靜脈擴張充血（圖1C）；48h時見肝細胞廣泛濁腫，大量點灶狀壞死，大量炎癥細胞浸潤，中央靜脈明顯擴張充血（圖1D）。

2.2 大鼠血清ALT、AST、TBIL檢測結果 模型組ALT在24、48h較對照組明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義（F=63.63，P＜0.01）；模型組 AST在6、24、48h較對照組明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義（F=76.15，P＜0.01），24h達頂峰，48h開始下降，但仍高于對照組；模型組TBIL水平在24h明顯升高，48h仍維持高水平，均與對照組比較差異有統計學意義（F=28.53，P＜0.01），見表1。

表1 各組血清ALT、AST、TBIL檢測結果（，n=8）

表1 各組血清ALT、AST、TBIL檢測結果（，n=8）

組別 ALT（IU／L） AST（IU／L） TBIL（mmol／L）對照組59.88±8.71 57.64±13.71 14.00±1.23模型組6h 504.50±143.61 626.875±143.53 25.36±12.09模型組24h3 204.88±791.40 3 662.50±725.66 65.10±23.15模型組48h2 382.88±695.54 1 936.63±727.83 58.49±3.43

圖1 各組小鼠肝臟病理組織圖 （HE×400）

2.3 肝組織細胞凋亡的TUNEL分析 如圖2A所示，對照組肝組織未見凋亡細胞。模型組6h可見少許凋亡細胞（圖2B），AI為6.40±1.43；24h及48h時凋亡細胞較6h增多（圖2C、D），AI分別為為29.30±4.19、33.00±6.99，與6h比較差異有統計學意義（F=9.92，P＜0.01）。

2.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平檢測結果 模型組TNF-α與IL-1β在6h即達峰值，與各組比較差異有統計學意義（F分別為317.57、38.64，P＜0.01），24h開始下降，48h明顯降低，與6h比較差異有統計學意義（F為102.65、19.15，P＜0.01），但仍高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肝細胞凋亡檢測結果（TUNEL×400）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α水平檢測結果（，n=8）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α水平檢測結果（，n=8）

Δ：P＜0.01，與對照組比較；＊：P＜0.01，與模型組6h比較。

組別 TNF-α（pg／mL） IL-1β（pg／mL）對照組22.35±1.24 47.13±6.51模型組6h 1 275.42±105.24Δ 100.75±14.31Δ模型組24h 1 128.56±87.34Δ＊ 84.25±11.74Δ＊模型組48h 563.47±119.72Δ＊ 64.75±8.03Δ＊

3 討 論

肝臟是機體重要的解毒器官，肝功能受損是燒傷、膿毒血癥、感染性休克等多種危重疾病后續出現多器官損傷和多器官功能衰竭的重要環節，而LPS血癥是引起肝功能損害的重要物質基礎之一［3］，因此，研究LPS所致肝損傷后的變化特點及作用機制具有重要意義。

由于LPS與存在于血漿中的LPS結合蛋白（LBP）結合后形成可溶性的LBP-LPS復合體，與肝細胞表面的CD14受體相結合，直接作用于肝細胞，通過一系列信號轉導過程激發細胞反應，產生多種生理效應和病理損害，形成對肝臟的第一次打擊［4］，導致肝細胞的破壞；D-GaLN作為肝細胞磷酸尿嘧啶核苷的消耗劑，具有高度特異性，對肝臟對LPS的敏感性有明顯的放大效應，兩者綜合作用肝臟后的病理表現為肝細胞彌漫性變性、壞死、炎癥細胞的浸潤等［5］。本研究通過利用LPS＋D-GalN誘導急性肝損傷，發現肝臟在6h即出現變性，24、48h出現壞死，中心靜脈擴張充血，大量炎癥細胞浸潤，而作為反應肝臟功能的重要指標模型組ALT、AST和TBIL在6h均有升高，24h明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），并達到頂峰，ALT、AST均在48h開始下降，但仍高于對照組，而TBIL在48h仍維持高水平。這與肝細胞病變出現的時間相吻合，這也提示了肝臟是重癥感染的受累器官之一，LPS肝損傷出現早、進展快，在短期內造成肝組織嚴重的病理損傷，因此，早期進行保肝治療顯得尤其重要。

細胞凋亡（apoptosis）是生物體內廣泛存在的由特定基因控制、以細胞DNA降解為特征、無明顯細胞溶解的細胞自殺過程，是機體維持自身穩定的一種機制。它不僅存在于生長、發育等一般的的生命過程，而且還廣泛參與了許多疾病的病理機制［6］。本實驗中發現肝細胞在LPS作用6h后就出現了凋亡，后隨著時間的推移，凋亡細胞逐漸增加，成為該急性肝損傷重要的形態學改變之一。LPS誘導肝細胞凋亡受復制的機制調控。研究表明，TNF-α在LPS肝損傷發生細胞凋亡中扮演了關鍵角色。Morikawa等［7］用LPS＋D-GalN誘導的急性肝衰竭，結果也發現了肝細胞的大量凋亡，他們的研究發現使用抗TNF-α的抗體可以阻止這種凋亡的發生；且重組TNF-α的應用也可引起D-GalN致敏小鼠發生肝細胞的凋亡，由此推斷TNF-α在肝細胞凋亡中扮演了重要的角色。Liu等［2］認為LPS誘導肝細胞凋亡在早期階段與誘導型一氧化氮合成的酶（iNOS）基因的高表達密切相關，而在中后期則受到了p53基因的調控；Kuhla等［8］也證實細胞毒性T淋巴細胞（NK）釋放的穿孔素（perforin），顆粒酶（granzyme）也介導了LPS誘導的肝細胞凋亡，在LPS＋D-GalN誘導6h可見兩者的大量釋放，引起細胞的凋亡明顯增加。除此之外，肝臟的孕烷X受體（PXR）也參與了LPS誘導的肝細胞凋亡，在PXR缺失鼠促分裂素原活化蛋白（MAP）激酶活性下降，并且延長了JAK2／STAT3介導的信號通路的活性，引起肝細胞凋亡增加［9］。

LPS除可直接引起肝細胞受損外，還可引起肝臟Kupffer細胞（kupffer cell，KC）高度活化，使其產生、釋放大量的活性介質（如TNF-α、IL-1、IL-6等），形成瀑布效應，對機體形成第二次打擊，進一步加重肝臟損傷［10］，此外，LPS還能誘導還能激活NALP3及NALP1炎癥小體（inflammasome），并進一步激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-1，活化的caspase-1能將前IL-1β和proIL-18分別剪切為IL-1β和IL-18，增加了IL-1β的生成［11］。TNF-α被認為是引起這一病理過程的始動因子，對肝細胞損傷起著主導性的作用，它對肝臟既可以直接產生損傷作用，還可以通過氧化應激途徑致病［12］；IL-1β則是重要的協同因子［13］，抑制兩者的產生能明顯減少LPS誘導的肝損傷［14-15］。本實驗進一步研究了LPS肝損傷后炎癥介質TNF-α、IL-1β變化特點，研究發現在LPS作用DGalN致敏肝臟6h后，TNF-α和IL-1β在6h即達到峰值，24h仍維持在較高水平，48h雖有下降，但仍高于正常，這既符合血清ALT、AST、TBIL水平及肝細胞凋亡檢測結果，也說明TNF-α、IL-1β在LPS肝損傷發生、發展中扮演了重要角色，他們的持續存在是引起了肝臟病理繼續惡化的重要物質基礎。由此可見，早期抑制包括TNF-α、IL-1β在內的炎癥介質的生成、釋放對指導臨床治療LPS急性肝受損具有重要的意義。

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