熒光實時定量PCR對肺癌相關基因檢測及其臨床意義

王明賢，楊 華，楊志強

（1.樂山職業技術學院，四川樂山 614000；2.中山大學醫學院，廣州 510080）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類生命及健康，發病率較高，且有繼續增高的趨勢。通過影像學及病理學檢查雖可發現，但由于無法發現隱性病灶、亞臨床病灶及微小轉移灶的資料與證據，目前做到早期發現尚存在一定的難度，大部分患者在出現臨床癥狀而就診時疾病已經處于中晚期，從而錯過手術時間窗。據統計，肺癌的5年生存率不足15%［1］。近年來，腫瘤基因類標志物研究取得長足進展，已經成為腫瘤分子診斷的重要內容之一，通過分析腫瘤相關基因的關系、類型、表達及缺陷等，最終達到腫瘤早期診斷的目的［2］。本研究采用熒光實時定量PCR對肺癌相關基因LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin進行檢測分析并建立輔助診斷指數，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年9月至2011年9月于中山大學醫學院胸外科行手術治療的肺癌患者34例，其中男19例，女15例；年齡27～67歲，平均（46.72±5.88）歲；所有患者均經過術后病理檢查確診。應用世界衛生組織（WHO）1999年對肺癌的組織學分類方法，發現小細胞肺癌（SCLC）患者12例，非小細胞肺癌（NSCLC）患者22例；按照國際抗癌聯盟（UICC）1997年對肺癌TNM分期方法進行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期4例。收集患者手術切除的腫瘤、腫瘤切緣組織及切緣周圍2cm組織。另取同期10例行肺大泡切除術患者肺組織作為正常對照組。本研究對術前評價具有手術適應證患者進行手術，有些SCLC以及Ⅳ期的NSCLC均為術后補充診斷。

1.2 方法

1.2.1 mRNA提取 將組織置入1.5mL的RNA裂解液（購自美國Promega公司），再加入11μLβ-巰基丙醇進行勻漿，分裝入離心管中，加入水飽和酚與氯仿，充分震蕩后冰浴30min后，于4℃以12 000r／min離心10min，吸取上清液，加入等體積異丙醇后12 000r／min離心15min。重新加入β-巰基丙醇、RNA裂解液與異丙醇，12 000r／min離心后留取沉淀。使用RNA提取試劑盒RNAgents（購自美國Promega公司）提取mRNA，具體步驟參照該試劑盒說明書。

1.2.2 逆轉錄 逆轉錄過程采用逆轉錄試劑盒ImRrom-Ⅱ（購自美國Promega公司）與 M-MLV試劑盒（購自美國Promega公司），采用隨機引物，整個過程均參照試劑盒說明書進行。

1.2.3 引物設計 引物設計均根據GenBank中LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin的mRNA序列進行，采用AllelelD 4.0軟件進行設計，最終由北京博奧森科技有限公司進行合成，具體序列如下。LUNX基因，上游：5′-CTC ATT GTC TTC TAC GGG CTG TT-3′，下游：5′-GGC AGG GCT GGA TTC ACA T-3′，片段大小104bp；CK-19基因，上游：5′-AGGTGG ATT CCG CTC CGG GCA-3′，下游：5′-AGC TCC CTG TCC TTC TAG TG-3′，片段大小338bp；CEA基因，上游：5′-TGC TCA CAG CCT CAC TTC-3′，下游：5′-CCA TCC ACT CTT TCA CCT T-3′，片段大小169bp；MUC1基因，上游：5′-CGT CGT GGA CAT TGA TGG TAC C-3′，下游：5′-GGT ACC TCC TCT CAC CTC CTC CAA-3′，片段大小287bp；Survivin基因，上游：5′-CCG CAT ACA GTC GAG AGA-3′，下游：5′-GTG TAG GGT GTA GAA TCC TGT TCA-3′，片段大小121bp。

表1 肝癌相關基因的差異表達（）

表1 肝癌相關基因的差異表達（）

基因 正常肺組織 手術切緣組織 癌旁組織 腫瘤組織P 8 0.002 CK19 1.53±3.72 15.39±4.11 29.48±3.20 34.75±3.25 0.001 CEA 1.50±0.33 8.96±2.54 139.69±27.04 696.58±130.05 0.000 MUC1 1.44±0.29 5.10±0.55 19.04±3.99 55.47±1.86 0.001 Survivin 1.05±0.32 4.77±5.21 11.93±3.30 95.LUNX 1.77±0.56 2.03±0.49 6.06±0.55 7.69±0.3 44±14.60 0.002

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用SYBR GreenⅠ染料法對樣本進行實時定量PCR反應，應用Ex Tap試劑盒以及熒光定量ABI 7900型（ABI，美國）實時定量PCR系統進行，操作均按照廠家及試劑盒說明書進行。PCR反應條件如下：95℃預變性2min，94℃變性45s，60℃退火1min，71℃延伸1min，共進行45個循環，循環結束后于71℃下延伸1min，所得結果用IQ5軟件進行讀數分析，內參采用G3PHD基因。待測基因相對表達量采用2-△△CT法進行計算（△CT=CT待測-CT內參；△△CT=△CT待測-△CT），當計算出的2-△△CT值相差3倍時，即認為相關基因有差異表達。

1.3 多個相關基因熒光實時定量PCR反應體系建立 將合成好的相關基因cDNA混合，連續進行2倍梯度稀釋，得到相關基因與內參G3PHD的熒光曲線，計算得到logcDNA濃度對△CT值直線，內參與待測基因擴增效率抑制，應用2-△△CT法適合對本研究結果進行分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS10.0軟件進行統計學處理，計量資料采用表示，組間差異比較采用t檢驗；計數資料采用百分比表示，組間差異比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2-△△CT法相關基因相對表達水平檢測 LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin基因表達均上調，分別上調88.23%，75.42%，85.01%，66.42%和70.66%；在正常肺組織、手術切緣組織、癌旁組織與腫瘤組織中表達兩兩比較或多個比較差異有統計學意義（P＜0.05），均具有從正常肺組織到腫瘤組織明顯遞減的趨勢。見表1。

2.2 建立分子輔助診斷指數 根據2-△△CT法所得數值，該5種肺癌相關基因在組織中上調3倍或3倍以上的個數建立分子輔助診斷指數（與正常肺組織相對表達量相差3倍者計為輔助診斷指數增加1）［3］，因此本研究中分子輔助診斷指數為0～5。經過計算可知，正常肺組織輔助診斷指數為1.2±0.51，手術切緣組織為2.4±0.64，癌旁組織為3.36±0.43，腫瘤組織為4.65±0.38。手術切緣組織、癌旁組織與腫瘤組織均較正常肺組織顯著升高，以腫瘤組織最為明顯。當以正常肺組織作為對照，設定輔助診斷指數大于或等于3.5為肺癌時，受試者工作特征曲線（ROC曲線）敏感度為95%，特異度為92%，陽性結果預示值（PPV）=95.33%，陰性結果預示值（NPV）=98.00%，說明分子輔助診斷指數可提高診斷準確性。

2.3 分子輔助診斷指數與WHO組織分型及UICC TNM分期的關系 對于12例SCLC患者及22例NSCLC患者，兩組輔助診斷指數分別為3.69±0.24與3.98±0.30，二者之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；對于TNM分期，以Ⅳ期患者得分最高，Ⅰ期患者得分最低，得分比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

隨著腫瘤分子生物學技術的不斷發展，對于腫瘤的發生、發展的認識亦在不斷更新。分子生物學技術對腫瘤基因標志物的檢測用于腫瘤發現與診斷，是目前的研究熱點之一［4］。傳統對于單基因的研究用于診斷腫瘤時，存在較高的假陽性與假陰性，從而造成漏診與誤診的發生［5］。因此，采用多個相關基因標志物聯合檢測并尋找新的標志物，可降低漏診、誤診的發生率，最終提高腫瘤的診斷率。

LUNX即肺特異性蛋白X，該基因定位與20p11.1-q12，長度為1 015bp，共編碼26個氨基酸，具有較強的組織特異度，在肺外未發現表達。LUNX對肺癌患者外周血／淋巴等部位的未轉移具有較高的特異度，因此可以作為一種新型的肺癌基因標志物［6］。LUNX mRNA在肺癌Ⅲ期與Ⅳ期的檢出率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，即LUNX mRNA的表達隨著TNM分期的提高而增高［7］。LUNX mRNA水平與腫瘤負荷及轉移程度密切相關［8］。CK-19屬于細胞角蛋白，是角蛋白的可溶性片段，可以作為上皮來源腫瘤的敏感標志物［9］。CEA是正常組織不表達的一種分泌糖蛋白，其基因水平檢查的敏感度高于蛋白水平?，F認為，如果檢出CEA mRNA，可以從理論上推斷有腫瘤細胞的存在［10］。已經有學者檢測患者體內 MUC1作為肺癌發生播散轉移的生物學標志，通過logistic回歸分析發現NSCLC患者外周血MUC1mRNA水平與TNM分期及腫瘤細胞分化程度均存在密切關系［11］。Survivin基因全長15kb，主要生理功能與胚胎細胞及增殖細胞的生長、分化有關。在大多數人類腫瘤存在高表達情況。研究發現，肺癌組織中Survivin mRNA水平高的患者預后較差，可作為判斷肺癌預后的指標［12］。

本研究在查閱文獻的基礎上，選擇肺癌組織中表達高、特異度好的上述基因，采用熒光實時定量PCR進行檢測并初步建立輔助診斷指數。LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin基因在肺癌組織中表達最高，正常組織中表達最低，符合既往文獻。統計得出的分子輔助診斷指數對于診斷肺癌有良好的特異度與敏感度。此外，該分子輔助診斷指數還與肺癌的TNM分期有關，分期愈高，分子輔助診斷指數愈高，說明該分子輔助診斷指數對于肺癌的臨床分期亦具有一定的預測與指導意義。

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