重慶永川地區人乳頭瘤病毒感染亞型、年齡分布及多重感染影響的研究＊

代紅瑩，張曉靜

（重慶醫科大學附屬永川醫院檢驗科 402160）

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種嗜黏膜和皮膚上皮的雙鏈閉合環狀的小DNA病毒，相對分子質量約為8×103。目前100多種亞型已被鑒定，其中約40余種與人類生殖器皮膚黏膜病變相關［1］。HPV亞型可分為高危型和低危型兩類，低危型以HPV-6、11最為常見，主要引起尖銳濕疣等良性病變；高危型以 HPV-16、18、31、52、58最為常見，常引起宮頸癌等惡性病變［2］。HPV亞型在不同地區不同人群分布情況不一［3］。目前，HPV在非洲和拉丁美洲的感染率較高，

絕大多數性活躍女性至少感染了一種HPV。本研究主要對重慶永川地區的適齡婦女進行23種常見亞型檢測，以確定重慶永川地區HPV感染的常見類型，為后續研究打下基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所有樣本均來源于重慶醫科大學附屬永川醫院，采集對象為2007年1月至2010年10月隨機前來醫院就診的患者。樣本采集后隔離保存于宮頸脫落細胞收集管中，并盡可能于樣本到達后的當天進行DNA分離處理，少數來不及處理的樣品置于-20℃冰箱中保存，1周內進行處理。

1.2 儀器和試劑 FYY-3型分子雜交儀（興化市分析儀器廠）、PCR擴增儀（杭州朗基有限公司）、HPV DNA分型基因芯片檢測系統（亞能生物技術有限公司）、其他試劑（國產分析純）。

1.3 方法

1.3.1 樣品HPV DNA獲取和處理 用宮頸脫落細胞采集器取得宮頸表皮脫落細胞，對于生殖器或肛周疣體增生（懷疑為尖銳濕疣）患者，用濕棉拭子采集疣體表皮脫落細胞或疣體組織。將取樣后的棉拭子或采集器放入備有1mL無菌生理鹽水的試管中，充分漂洗后將棉拭子貼壁擠干，安全丟棄。將漂洗過的生理鹽水或洗脫液全部轉移到1.5mL微量離心管中，13 000r／min離心10min，棄去上清，保留管底的細胞塊，加入50mL細胞裂解液懸浮沉淀，沸水浴10min，13 000r／min離心10min，-20℃保留上清待用。疣體組織DNA的提取用組織DNA提取試劑盒按使用說明書方法提取。

1.3.2 HPV DNA片段的PCR擴增 取PCR反應管于5 000 r／min離心2s，根據HPV L1基因設計23種亞型的特異性探針，針對這一片段設計通用引物，同時以人類基因組的看家基因beta-globin作為PCR對照。按以下條件進行擴增：50℃15 min，95℃10min，94℃30s，42 ℃ 90s，72℃ 30s，40個循環，72℃5min。PCR反應體系為：ddH2O 14.2μL，反應緩沖液（含 MgCl2）2.5μL，三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）2μL，引物0.5μL／條，樣品DNA 5μL，Taq酶0.3μL，反應總體系25μL。

1.3.3 雜交和顯色 取15mL塑料離心管，標明編號，放入標有同樣編號的膜條，加入A液5mL（2×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）及所有PCR產物。將塑料管放入沸水浴中加熱10min，放入雜交箱51℃雜交1.5h。同時取50mL塑料管，加入40 mL B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）于雜交箱或水浴箱中預熱至51℃。取出膜條，移至裝有預熱B液的50mL管中，于51℃輕搖洗滌15min。A液配制1∶2 000的過氧化物同工酶（POD）溶液，室溫輕搖浸泡膜條15min。棄去POD溶液，用A液室溫輕搖洗2次，每次5min，然后再用C液室溫洗膜1～2 min。同時配制顯色液，將膜條浸泡于顯色液中避光顯色15min左右，即可見斑點顯現，若顯色較弱可適當延長顯色時間，顯色完畢將膜條浸泡在水中清洗，最后取出膜條于4℃保存。

1.3.4 結果判定 膜條上有24個方格，依次排列著23種HPV型別，另一個方格為質控點。結果判定時，首先看膜條的質控點是否有藍色圓點出現，若有則判本次實驗成功，然后看哪些方格有藍色圓點出現，哪個方格有藍色圓點出現則判定與其相對應的HPV型陽性，每次實驗都設有陰性和陽性對照。

1.4 統計學處理 用Micro EXCEL軟件建立數據庫，制作表單進行數據的錄入，最后得到成型的數據庫，用SPSS13.0軟件進行統計分析，對目前公認的18種高危型，5種低危型在不同人群中的分布進行統計描述和分析。

2 結 果

2.1 HPV感染的型別分布 在檢測出的955例陽性標本中，除HPV-44、MM4未檢測出來外，其他各型均有檢出。其中高危型感染 HPV-16最多為（34.45%），其次為HPV-58（11.52%）；低危型感染HPV-43為首（9.84%），其次為 HPV-11（8.69%）。高危型檢出數是低危型檢出數的3.5倍。

表1 HPV亞型感染情況

續表1 HPV亞型感染情況

2.2 HPV各型感染情況 在混合感染的249例標本中，兩種亞型的混合最為常見，占感染檢出率的19.27%；3種及以上亞型感染檢出率僅占總感染的6.81%。高危型和低危型混合感染110例，占總感染11.52%；高危型混合感染118例，占總感染的12.36%；低危型混合感染13例，占總感染的1.36%。

表2 HPV感染情況

2.3 HPV感染的年齡分布 本研究將感染者分為≤20歲、＞20～30歲、＞30～40歲、＞40歲4個年齡組，其HPV的感染率依次為6.49%、22.93%、39.27%、31.31%，＞30～40歲年齡組是HPV感染的主要年齡階段。

表3 不同年齡HPV感染情況

3 討 論

3.1 HPV感染狀況 HPV是一種通過性生活傳播的病毒，通常感染沒有明顯癥狀。據統計，至少有50%的婦女其一生都會感染HPV，而50歲之前感染HPV的幾率高達80%。非洲HPV感染率約22.1%，亞洲8.0%，北美洲11.3%，中美洲和墨西哥20.4%，歐洲8.1%［4］，不同地區有一定差異，這可能是由于HPV本身的地域性差異及不同的研究者選擇的目標人群和采用的檢測方法不同引起的。

3.2 HPV亞型分布特點 研究表明，HPV亞型分布也存在地域性差異，不同亞型 HPV感染致癌性及其后果不同［5］。Bao等［6］研究的中國宮頸癌常見亞型為 HPV-16、18、58、33、52、45、31及35型；宮頸癌前病變中常見亞型為 HPV-16、58、52、18、33、31。

本研究顯示HPV高危型感染中常見的亞型為HPV-16、58、52、33、18、66、56，與前人的研究有所偏差，原因可能歸結為HPV亞型分布的地域性差異；低危型感染中 HPV-43、11、6、42均占有較大比例，與前人結果比較6、11沒有占有主導地位，但是4種亞型均是廣范圍報道的HPV低危型亞型。

3.3 單一感染與多重感染 本研究中HPV多重感染的比例為26.08%，低于Bachtiary等［7］（43.9%），與其他文獻一致［8］。不少學者認為HPV的多重感染并不少見，檢出率高低除與研究人群有關外，還與檢測方法有關。在本研究中，多重感染主要是二重感染，最常見的為HPV-16合并的感染。Ho等［9］學者認為HPV多重感染者出現持續感染的危險性更大，支持本研究結果。

3.4 HPV與宮頸癌的關系 宮頸癌發病率高，在女性惡性腫瘤的發病率中位居第2。研究表明，HPV的持續感染是宮頸癌及宮頸上皮內瘤變（CIN）的主要病因。高危型HPV的持續感染是宮頸癌及其癌前病變發生、發展的必要條件。宮頸癌患者的高危型HPV感染陽性率為100%，CINⅡ和CINⅢ為97%，CINⅠ為61.4%。

不同HPV亞型的致病力不同，據 Munoz等［10］統計，雖然各級別病變間感染型別存在差異，但高危型HPV-16、58、18、56、33在各級別病變組均占有一定優勢，本研究亦支持上述結果。HPV多重感染率隨病變級別增加而增加，一定程度上說明多重感染對宮頸病變的發生、發展起促進作用。結果與Fife等［11］的研究一致，但也有不少學者提出反對意見［10］。

3.5 HPV與年齡的關系 HPV與年齡具有相關性，據de Sanjose等［4］的研究顯示：HPV感染高峰在34歲之前，35～44歲的HPV感染率隨之降低，而對于大于45歲組，除亞洲外其他地區的感染率又有所增加。本研究結果有所不同，原因可能在于，統計的標本量有限，不能客觀反映HPV感染年齡本身，也存在患者來源集中的問題，HPV感染一般癥狀不明顯，很多年輕婦女忽略了HPV的常規檢查也是一個很大的因素。

［1］Steben M，Duarte-Franco E.Human papillomavirus infec-tion：epidemiology and pathophysiology［J］.Gynecol Oncol，2007，107（2）：2-5.

［2］Paavonen J.Human papillomavirus infection and the development of cervical cancer and related genital neoplasias［J］.Int J Infect Dis，2007，11（2）：3-9.

［3］Clifford GM，Gallus S，Herrero R，et al.Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the international agency for research on cancer HPV prevalence surveys：apooled analysis［J］.Lancet，2005，366（9490）：991-998.

［4］de Sanjose S，Diaz M，Castellsague X，et al.Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology：a meta-analysis［J］.Lancet Infect Dis，2007，7（7）：453-459.

［5］Clifford GM，Swith JS，PlummerM，et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide：a meta-analysis［J］.Br J Cancer，2003，88（1）：63-73.

［6］Bao YP，Li N，Smith JS，et al.Human papillomavirus typedistribution in the cervix of Chi-nese women：a meta-analysis［J］.Int J STD AIDS，2008，19（2）：106-111.

［7］Bachtiary B，Obermair A，Dreier B，et al.Impact of multiple HPV infection on response to treatment and survival in patients receiving radical radiotherapy for cervical cancer［J］.Int J Cancer，2002，102（3）：237-243.

［8］Huang LW，Chao SL，Wang JL，et al.Hunam papillomavirus-31-related types predict better survival in cervical carcinoma［J］.Cancer，2004，100（2）：327-334.

［9］Ho GY，Bierman R，Beardsley L，et al.Natural history of cervicov-aginal papillomavirus infection in young women［J］.N Engl J Med，1998，338（7）：423-428.

［10］Munoz N，Bosch FX，Sanjose S，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer［J］.N Engl J Med，2003，348（6）：518-527.

［11］Fife KH，Cramer HM，Schroeder JM，et al.Detection of multiple human papillomavirus types in the lower genital tract correlates with cervical dysplasia［J］.J Med Virol，2001，64（4）：550-559.