限制性應激在實驗性牙周炎牙槽骨吸收中的作用＊

周陽明，衛光曦，倪 靈，萬朝霞

（1.重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科 401147；2.重慶醫科大學附屬口腔醫院牙體牙髓科 400015）

牙周炎（periodontitis）是人類最常見的口腔感染性疾病之一，是造成牙槽骨吸收、牙松動脫落的主要原因，對口腔組織的健康有很大的危害。大量研究發現，牙周微生物在牙周病的發病中是必需的始動因素，但單純的細菌因素不足以解釋疾病的復雜性和嚴重性。易感的宿主及某些能增加宿主易感性的因素是影響牙周病發生、發展和對治療反應的重要因素［1］。應激指機體在遭受各種有害刺激時所處的一種狀態，此狀態的基礎是體內出現一系列神經內分泌反應［2-4］。許多心理免疫學和流行病學研究證實，免疫系統作為牙周病的調節因素，可被心理應激反應通過神經內分泌系統影響并調節牙周炎的發生［5-6］。

本研究擬通過建立大鼠應激牙周炎實驗動物模型，探討限制性應激在實驗性牙周炎發生、發展過程中的作用，從而為進一步闡明應激在牙周炎發生過程中的作用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠實驗性牙周炎動物模型 清潔級雄性SD大鼠48只，6周齡，體質量160～180g，購于重慶醫科大學實驗動物中心。無特殊致病菌的環境中適應性飼養1周后實驗。這項研究中所有大鼠的處理得到中國重慶醫科大學動物倫理委員會同意。

實驗性牙周炎模型的建立：參照Kimura等［7］的方法，選定大鼠左上頜第一磨牙為實驗牙，在其頸部用浸有牙周致病菌的0.012mm不銹鋼結扎絲進行結扎，并使結扎絲盡量位于齦溝內，結扎絲在整個實驗過程中一直保留作為口腔微生物的滯留裝置（圖1）。右上頜第一磨牙不做任何處理，作為陰性對照。

1.2 實驗分組 結扎后隨機分為應激組和非應激組，每組分2個亞組，各12只。空白組（G1組）：非應激大鼠右上頜第一磨牙；單純性牙周炎組（G2組）：非應激大鼠左上頜第一磨牙；限制性應激組（G3組）：應激大鼠右上頜第一磨牙；限制性應激＋牙周炎組（G4組）：應激大鼠左上頜第一磨牙。應激刺激方案執行后第2、3、4、5周，在應激大鼠和非應激大鼠中隨機處死6只。

1.3 牙齦指數的測量 參照文獻［8］報道對牙齦情況進行分級。0表示牙齦健康；1表示牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2表示牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3表示牙齦嚴重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。栓絲后1、2、3、4周后，使用鈍頭牙周探針檢查大鼠牙周情況，探診檢查實驗牙牙齦的頰側中部、頰側遠中和腭側中部、腭側遠中，這4個點的均值代表該牙的分數。

圖1 結扎左上頜第一磨牙

1.4 應激刺激方案 牙周炎實驗動物模型建立成功后，隨機選取24只大鼠進行限制性應激刺激：將大鼠用自制的大鼠制動器（圖2）固定身體，動物不能隨意移動，不能進食，可以進水，每天制動12h。

圖2 大鼠制動器

1.5 促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質酮（CORT）的測定各組大鼠處死前于非麻醉狀態下取尾部末梢血0.5mL置于肝素抗凝管，冰凍保存待測；麻醉后心臟穿刺取血2mL置于肝素抗凝管，37℃恒溫水浴2h，3 000r／min離心20min，取上清液（血漿），冰凍保存待測；將血液和血漿標本采用放射免疫分析法分別測定ACTH、CORT。

1.6 檢測牙槽骨喪失程度（AL） 各組大鼠處死后取上頜骨，去凈軟組織，用1%亞甲基藍液顯示牙槽嵴頂的位置。測量上頜第一磨牙頰側中部、頰側遠中、腭側中部、腭側遠中的釉牙骨質界至牙槽嵴頂的距離，這4個位點測量值的均值作為該牙的AL。

1.7 統計學處理 采用SPSS10.0軟件進行數據處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠牙周炎動物模型牙齦指數 在各個時間段，牙周結扎側牙齦指數明顯高于未結扎側（P＜0.01）。證實牙周結扎能造成大鼠實驗性牙周炎，見表1。

表1 牙齦指數（）

表1 牙齦指數（）

＊：P＜0.01，與牙周未結扎側比較。

組別 第1周 第2周 第3周 第4周牙周未結扎側0.33±0.11 0.44±0.14 0.41±0.21 0.38±0.17牙周結扎側 0.64±0.14＊1.22±0.22＊1.76±0.25＊2.38±0.17＊

2.2 ACTH和CORT檢測結果 應激組大鼠體內的ACTH和CORT水平明顯高于同時期非應激組大鼠（P＜0.01），見表2。在前3周，應激組大鼠ACTH水平呈遞增趨勢，但第5周ACTH水平含量較第4周有所下降。從第2周開始，應激組大鼠CORT含量逐漸增高，并且第5周應激組大鼠CORT含量與非應激組相比差距最明顯（P＜0.01），見表3。

表2 ACTH含量比較（，pg／mL）

表2 ACTH含量比較（，pg／mL）

＊：P＜0.01，與非應激組比較。

組別 第2周 第3周 第4周 第5周非應激組 40.62±6.98 46.18±9.80 46.12±8.84 49.62±4.40應激組 66.72±7.08＊91.44±4.59＊96.48±14.01＊85.94±5.99＊

表3 CORT含量比較（，pg／mL）

表3 CORT含量比較（，pg／mL）

＊：P＜0.01，與非應激組比較。

分組 第2周 第3周 第4周 第5周非應激組 207.38±19.49 217.76±52.28 215.90±11.01 241.62±32.83應激組 370.18±28.15＊347.88±40.33＊383.10±31.58＊411.66±9.78＊

2.3 AL檢測結果 通過對G1組和G2組大鼠上頜第一磨牙AL的比較可以發現，栓絲后的G2組大鼠的AL均高于未栓絲的G1組大鼠（P＜0.01）。從第2周開始，AL逐漸增高，證明牙周炎大鼠的模型建立成功。與G2組比較，在給予限制性應激處理后的G4組大鼠的AL均明顯高于在同一時間檢查的G2組大鼠（P＜0.01），并且第5周兩組間差距最大。通過對G4組大鼠不同時間內檢測的AL數據進行分析可以發現，從第2周開始，隨著應激時間的增加，AL也會有所增加（P＜0.01）。G1組和G3組之間沒有明顯差異（P＞0.05），見表4。

表4 各組AL檢測結果（，mm）

表4 各組AL檢測結果（，mm）

組別 第2周 第3周 第4周 第5周G1組0.06±0.02 0.07±0.02 0.08±0.04 0.10±0.05 G2組 0.83±0.14 1.06±0.20 1.17±0.19 1.42±0.26 G3組 0.08±0.05 0.10±0.04 0.07±0.05 0.09±0.04 G4組1.90±0.14 2.39±0.22 2.68±0.19 2.98±0.22

3 討 論

3.1 模型建立的評價 國外有研究結果證明，大鼠是嚙齒類動物，其牙槽骨、牙齦及牙周組織學特征與人類相似，適合作為牙周炎動物模型。SD大鼠的生物學特性還包含：（1）是晝伏夜動雜食動物；（2）喜啃咬，性情較溫順，抗病力強；（3）大鼠汗腺不發達；（4）嗅覺靈敏；（5）對噪聲敏感；（6）垂體、腎上腺功能發達，應激反應敏感，行為表現多樣等。基于上述這些特性，SD大鼠非常適合建立牙周炎應激模型［9］。牙頸部結扎是誘發大鼠牙周炎的傳統方法，通過結扎促進局部菌斑、牙石堆積形成，從而引發牙周組織的破壞，已是一種較成熟的方法。本實驗通過對大鼠結扎側和未結扎側牙齦指數及AL結果的對比可以證明，牙頸部結扎可以有效導致大鼠結扎區牙周炎的發生。

3.2 限制性應激牙周炎的影響 任何軀體或心理的刺激，只要達到一定強度，除了引起與刺激因素直接相關的特異性變化外，還可以引起一組與刺激因素非直接關系的全身非特異反應，這種反應就是應激。關于應激對牙周炎影響的臨床研究已有很多報道，但基于動物實驗的研究不多，尤其是在國內，很少有相關研究。

從目前的研究結果可以得知，應激反應通過神經和神經-內分泌調節免疫系統的途徑至少有3條［10-12］。（1）下丘腦-下垂體-腎上腺素（HPA）軸：應激使HPA加強了促進促進腦垂體分泌ACTH，從而使糖皮質激素產生并釋放進入體循環［13］。糖皮質激素的增多不僅使血糖升高，并且抑制從Th1到Th2的炎癥反應。（2）交感神經系統：應激激活了支配免疫系統的交感神經纖維，釋放兒茶酚胺導致腎上腺分泌去甲腎上腺素和腎上腺素。（3）感覺肽能神經途徑：應激促進感覺神經纖維釋放P物質、生長激素抑制素及神經生長因子等神經肽，從而介導神經源性的炎癥反應，并調節免疫系統的活性和細胞素的釋放。因此，應激可以通過這3條途徑對牙周病發揮各種不同的作用。在以往的國內外研究中［14-15］，嘗試構建心理應激的方式有很多，如冰敷法、減尾法、高溫刺激等不同方式來嘗試使實驗樣本產生并達到預期的心理應激反應。但是，通過制動來引發的限制性應激在強度、頻率、持續的時間等方面便于控制，所以目前被國內外廣大學者所采納。

本實驗所采用的制動器是根據限制性應激所需要的條件自制的一個制動器。它在不會過分加壓的情況下，可以限制大鼠的自由活動（力量可以調節），同時不會影響到大鼠呼吸和進水。在將大鼠從制動器放回籠中后方便對其進行沖洗保持里面環境的清潔，完全符合限制性應激制動的要求。ACTH和CORT是提示機體是否發生應激反應的最重要、最經典的指標之一。本實驗在對大鼠牙周炎模型加入限制性應激后，檢測出大鼠體內應激指標ACTH和CORT含量在應激組均增高，表明實驗動物內分泌系統對應激刺激發生了反應，證明應激牙周炎動物模型建立成功。再通過對本實驗中各組AL的測量和比較，可以發現在加入限制性應激這一條件后，應激組大鼠結扎側AL明顯高于非應激組大鼠結扎側AL，說明限制性應激會加重已發生牙周炎的大鼠牙周組織的牙槽骨吸收，而應激組大鼠未結扎側AL與非應激組大鼠未結扎側AL無明顯差異，這說明應激這一因素對未發生牙周炎的大鼠牙周組織沒有影響。通過對應激組大鼠結扎側前4周的AL進行比較可以發現，隨著應激時間的增加，AL也會增加，證明應激時間的長短與大鼠牙周組織的AL呈正相關。而應激加重牙周炎的原因可能在于在應激狀態下，宿主的免疫機制發生改變，各種炎癥介質釋放增加，使得宿主對局部菌斑等不良刺激更加敏感，從而加重了炎癥進程。

很顯然，大鼠適合用牙頸部結扎的方法建立限制性牙周炎模型來研究應激與牙周炎的關系。應激對沒有發生牙周炎的牙周組織無任何影響，但對已發生了牙周炎的牙槽骨吸收有促進作用，可以加重牙周炎的發展。隨著應激時間的增加，牙槽骨的吸收程度也會加重。但是，目前關于應激與牙周組織炎癥的聯系在分子生物學水平上的解釋仍然是模糊不清的，還需對其進行更加深入的研究。

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