當歸多糖對衰老模型小鼠學習、記憶能力及腦組織凋亡蛋白表達的影響*

李雪燕，陳開兵，張麗云

(1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫學院附屬醫院，甘肅蘭州730000)

當歸為傘形科植物當歸的干燥根，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經，具有補血活血、調經止帶、潤腸通便等功效，在臨床中被廣泛應用［1］。當歸多糖為當歸的有效成分之一，有研究［2］報道其具有延緩衰老的作用，但機制尚不十分清楚。本研究通過觀察當歸加多糖對D－半乳糖和亞硝酸鈉聯合腹腔給藥所致亞急性衰老擬癡呆模型小鼠的學習、記憶能力及凋亡相關蛋白表達的影響，從細胞凋亡角度進一步探討其延緩衰老的機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，由甘肅中醫學院科研動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 藥品、試劑與儀器

當歸多糖，陜西慈緣生物技術有限公司生產，批號CY110320，用生理鹽水配制成10 g/L的儲備液，備用;腦復康，湖南迪諾制藥有限公司生產，批號101110。D－半乳糖，北京化學試劑公司產品，批號020123，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用;亞硝酸鈉，西安化學試劑廠產品，批號860723，臨用前用生理鹽水配制成9 g/L備用;Bcl-2蛋白ELISA試劑盒(批號20120703)和Bax蛋白ELISA試劑盒(批號20120715)，上海江萊生物科技有限公司產品。SK3300H型數控超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司產品;BS224S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品;HH－4數顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產品;XYJ80－20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實業有限公司產品;ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic公司產品;WGC小鼠水迷宮，安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司產品;RT－6100型酶標儀，美國Rayto公司產品。

1.3 動物分組、給藥與模型的建立

將72只小鼠按照隨機數字表法分為空白對照組，模型對照組，腦復康組，當歸多糖低、中、高劑量組6組，每組12只。除空白對照組外，其余各組每日腹腔注射 D－半乳糖 120 μg/g和亞硝酸鈉90 μg/g［2－3］聯合給藥建立衰老小鼠模型;空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續30 d。30 d后，在腹腔注射的同時，腦復康組給予腦復康200 μg/g，當歸多糖高、中、低劑量組分別按照 400，200，100 μg/g灌胃給藥;模型對照組及空白對照組灌服等體積的生理鹽水，連續6周。

1.4 檢測指標

1.4.1 學習成績和記憶成績

末次給藥后，進行Y型迷宮試驗［4］。迷宮共分為3個互通的臂，實驗測試時，加入溫水(維持25±2℃)，使水面高于平臺約1 cm，再加入原味奶粉，使水成不透明乳白色。工作電壓50～70 V。以A為起步區，B為安全區，C為危險區。小鼠在起步區受到電擊后，1次性跑入安全區為正確，否則為錯誤，此即為1次訓練。下1次訓練以B為起步區，C為安全區，A為危險區，依次往復。共訓練33次，其中前3次作為小鼠適應環境不進入統計，記錄后30次中的錯誤次數，為學習成績。24 h后，用同樣的方法測試，為記憶成績。

1.4.2 腦組織生化指標

Y型迷宮測試后，將小鼠快速斷頭處死，取其腦組織用生理鹽水制成10 g/L腦勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液備用。ELISA法測定Bcl-2蛋白和Bax蛋白含量。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠學習和記憶成績對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠學習記憶能力下降，表現為學習成績和記憶成績測試中的錯誤次數增多，差別有統計學意義(P＜0.01)，說明造模成功。與模型對照組對比，腦復康組和當歸多糖3個劑量組小鼠學習和記憶中的錯誤次數均減少，差別有統計學意義(P＜0.01或 P＜0.05)，尤以當歸多糖中、高劑量組明顯(P＜0.01)，且此兩組與腦復康組對比，差別亦有統計學意義(P＜0.01或 P＜0.05)。見表 1。

表1 各組小鼠學習和記憶成績對比 ±s

表1 各組小鼠學習和記憶成績對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復康組對比，△ P ＜0.05，△△ P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) 每30次中錯誤次數學習成績/次 記憶成績/次12 － 17.07 ±1.39 14.40 ±1.50模型對照組 12 － 19.07±1.83＊＊ 17.01±1.36＊＊腦復康組 12 200 16.27 ±1.49## 14.93 ±1.03##當歸多糖低劑量組 12 100 17.07 ±1.39# 15.60 ±1.24#當歸多糖中劑量組 12 200 14.53±1.46##△ 13.40±2.59##△當歸多糖高劑量組 12 400 14.07±1.28##△△ 12.80±2.18##△△空白對照組

2.2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白的含量均升高，差別有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，腦復康組和當歸多糖3個劑量組Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差別有統計學意義(P＜0.01或 P＜0.05)。與腦復康組對比，當歸多糖高劑量組Bcl-2蛋白含量增高、Bax蛋白含量降低，差別有統計學意義(P＜0.01)。見表 2。

表2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比 ±s

表2 各組小鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白含量對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與腦復康組對比，△△ P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) Bcl-2蛋白/(μg·L－1) Bax蛋白/(μg·L－1)12 － 2.60 ±0.46 4.66 ±0.42模型對照組 12 － 3.33±0.43＊＊ 6.11±1.20＊＊腦復康組 12 200 4.14 ±0.56## 5.35 ±0.41##當歸多糖低劑量組 12 100 3.87 ±0.45# 5.54 ±0.48#當歸多糖中劑量組 12 200 4.36 ±0.37## 4.99 ±0.52##當歸多糖高劑量組 12 400 5.03±0.25##△△ 4.62±0.33##△△空白對照組

3 討論

細胞凋亡是一個主動的、有序的、受控的過程，參與調控的基因目前已發現幾十個，按其功能可分為促凋亡基因(如Bax，p53，Caspase等)和抗凋亡基因(如 Bcl-2，Bcl-x，Hsp等)兩大類，由這些基因編碼的蛋白質產物參與決定了細胞的存活或死亡［5－6］。促凋亡基因和抗凋亡基因組成一個平衡體系，任何因素破壞這一平衡體系就會導致細胞對外界的敏感性增加，從而破壞其結構和功能。多種因素導致的細胞凋亡和多種因素的抗凋亡作用都會通過調控 Bcl-2 家族的表達而完成［7－8］。因此，Bcl-2和Bax在腦衰老的發生和發展中起到重要作用，Bcl-2和Bax的表達強度決定細胞命運，Bcl-2占優勢時細胞生存，Bax占優勢時細胞死亡［9］。

已有研究［1－2］證實，當歸及當歸多糖確有延緩衰老的作用，但對其機制的研究主要集中于自由基學說。鑒于此，本實驗進一步檢測了當歸多糖對亞急性衰老擬癡呆模型小鼠學習、記憶能力及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。結果表明:造模后，在機體的自我保護機制下，Bcl-2蛋白表達反應性增強，且啟動了凋亡程序，Bax表達增強，破壞了Bcl-2/Bax基因平衡，導致Bcl-2/Bax的比值下降，促進細胞凋亡的發生。藥物干預后，當歸多糖低、中、高劑量組均能使小鼠腦組織中Bcl-2表達增強，Bax表達減弱，Bcl-2/Bax的比值增高，抑制細胞凋亡，從而達到延緩衰老，改善衰老模型小鼠學習、記憶能力的目的，尤以高劑量組最為明顯，差別有統計學意義(P＜0.01)。說明當歸多糖低劑量已表現出不同程度的延緩衰老作用，高劑量作用更為理想。然而，細胞凋亡是通過一系列連鎖反應實現的，涉及不同基因及其產物的調控和信號傳遞系統的正負調節，故當歸多糖抑制腦細胞凋亡的信號轉導機制有待進一步深入研究。

［1］李麗麗，劉向前，張曉丹.當歸屬植物研究進展［J］.中成藥，2009，31(4):601 －607.

［2］徐露，董志.當歸多糖抗衰老的實驗研究［J］.激光雜志，2008，29(4):89 －90.

［3］張妍.復方丹參對早老性癡呆動物的作用及機制研究［D］.北京:北京中醫藥大學，2008.

［4］王躍春，王子棟，孫黎明，等.動物學習記憶能力的Y－型迷宮測試法［J］.暨南大學學報:自然科學版，2001，22(5):137.

［5］Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26(4):239.

［6］Williams GT，Smith CA.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death［J］.Cell，1993，74(5):777.

［7］Desagher S，Martinou JC.Mitochondria as the central control point of apoptosis［J］.Trends Cell Biol，2000，10(9):369.

［8］Parone P，Priault M，James D，et al.Apoptosis:bombarding the mitochondria［J］.Essays Biochem，2003，39:41 －51.

［9］Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer＇s disease［J］.Neuroreport，1994，5(18):25 －33.