載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球對人宮頸癌Hela細胞生長抑制作用研究

陳道楨，王常在，陳萬瑛，李向東，劉 樓，張 婷，陳 鈺，鄒 萍

（1.南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院，江蘇 無錫214002；2.新疆阿合奇縣人民醫院，新疆克州843500）

近年來，國內外大量的研究已證明20（S）－人參皂苷Rg3在腫瘤治療方面有廣闊的應用前景［1－3］。但傳統制劑的臨床應用目前仍存在不少問題，如顆粒偏大、不溶于水，生物利用度較低等等，極大限制了其臨床應用。本研究采用納米技術，制備了載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球并觀察了載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球（SPG－Rg3－HAS－NP）對人宮頸癌Hela細胞體外增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

人宮頸癌Hela細胞株購于武漢大學中國典型培養物保藏中心（CCTCC）；20（S）－人參皂苷Rg3購自上海純優生物科技有限公司，純度≥97%，人血清白蛋白購自上海生工生物科技有限公司：胎牛血清和RPMI1640培養基為美國Gibco BRL公司產品，二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品，四甲基偶氮唑藍（MTT）為美國Pharmingin公司產品，用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解成5g/L，避光儲存于4℃；其余試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器

BS－110S型電子天平（德國Sartorius公司），GL－2型恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）.；SB5200型超聲波（上海Branson公司），MM1微型振蕩器（上海精密生化儀器廠），CO2培養箱（三洋公司），B10－Rad 550酶標儀（日本）。

1.3 細胞培養

人宮頸癌Hela細胞用RPMI1640培養基培養，各培養液中均常規加入10%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml。

1.4 SPG－Rg3的配制

將SPG－Rg3粉末用DMSO溶解，用含10%新生胎牛血清的RPMI1640培養液稀釋成實驗所需的各種不同濃度，DMSO終濃度＜0.01%。

1.5 載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球（SPGRg3－HAS－NP）制備

采用乳化熱固化法制備載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球，該法正在申報國家專利。同時制備空白白蛋白納米粒（HAS－NP）［4］。納米粒使用前均經60鈷輻射消毒備用。

1.6 MTT實驗

①實驗分組：A：生理鹽水對照組；B：空白白蛋白納米粒（HAS－NP）組；C：20（S）－人參皂苷組（SPG－Rg3）；D：載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球組（SPG－Rg3－HAS－NP）；其中B和D組白蛋白濃度一致，C和D組SPG－Rg3藥物濃度一致。②用藥濃度（按照所包 Rg3計算）：10、20、40、80、160 μg/ml。③觀察時間：給藥后24h、48h、72h和96 h 4個時間點。④MTT實驗：將人宮頸癌Hela細胞接種于96孔細胞培養板 （1.5×104個細胞/孔），置37℃5%CO2培養箱培養；24h后，待細胞貼壁生長良好時，按照是實驗分組給藥，每個濃度級設3個復孔。給藥后分別繼續培養24h、48h、72h和96h，每孔加入MTT溶液50μl（1mg/ml），繼續培養4h；加入150μl/孔DMSO溶解沉淀，微型振蕩儀振蕩10min混勻，用酶標儀測定490nm波長吸光度（OD）值，取3孔吸光度平均值。以不加任何細胞的一孔為空白調零，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率＝（1－實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.7 統計學方法

用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差表示，多個樣本均數間的兩兩比較采用方差分析q檢驗；多個實驗組與一個對照組均數間的比較采用方差分析q’檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 空白白蛋白納米粒的細胞毒性

實驗結果顯示，在24h、48h、72h和96h4個時間點，空白白蛋白納米粒（HAS－NP）組對Hela細胞的抑制率與生理鹽水組相比，無統計學意義（P﹥0.05），與SPG－Rg3組和 SPG－Rg3－HAS－NP組相比，有統計學意義（P＜0.05），故可以認為不含藥白蛋白納米微球對Hela細胞無明顯細胞毒作用，且不具有時間和濃度依賴性。故可認為這種抑制Hela細胞生長作用是由于SPG－Rg3或SPG－Rg3－HASNP釋放出的SPG－Rg3作用的結果造成的。

2.2 Hela細胞生長抑制率與藥物濃度和作用時間相關性

MTT法檢測Hela細胞生長抑制率與藥物濃度和作用時間相關性結果見（圖1和圖2）。從圖可以看出，給藥24h、48h、72h和96h后，SPG－Rg3和SPGRg3－HAS－NP組的細胞生長抑制率均與給藥濃度呈正相關，且隨著作用時間的延長，細胞抑制率仍繼續增加。說明Hela細胞生長分別與兩組藥物的給藥濃度和時間呈一定的濃度依賴性和時間依賴性。

2.3 Hela細胞生長抑制率的組間差異比較

圖3A和3B顯示，在24h、48h時SPG－Rg3組各濃度值下的細胞抑制率高于SPG－Rg3－HAS－NP組細胞抑制率，但兩組細胞抑制率相比無統計學意義（P＞0.05）；而在72h后，SPG－Rg3－HAS－NP組在各個濃度點的細胞抑制率均明顯超過SPGRg3組的細胞抑制率，且兩組細胞抑制率相比有統計學意義（P＜0.05）（圖3C）；SPG－Rg3組在80μg/ml濃度以后似已進入平臺期甚至出現曲線下行的趨勢，而SPG－Rg3－HAS－NP組的細胞生長抑制曲線仍繼續上升，72h后于20μg/ml濃度處抑制率已超過SPG－Rg3組（P＜0.05）（圖3C、3D）。實驗結果顯示SPG－Rg3－HAS－NP組藥物對Hela細胞的抑制有一定的時間延續性，表明藥物具有一定的緩釋作用。

圖1 Hela細胞生長抑制率與SPG－Rg3濃度和作用時間的相關性

圖2 Hela細胞生長抑制率與SPG－Rg3－HAS－NP濃度和作用時間的相關性

圖3 不同時間點SPG－Rg3與SPG－Rg3－HAS－NP濃度和細胞生長抑制率的相關性

3 討論

納米藥物是指以納米級高分子納米粒（nanoparticles，NP）或納米球（nano－spheres，NS）、納米囊（nano－capsules，NC）等為載體，與藥物以一定方式結合在一起后制成的藥物［5］。運用納米技術的藥物可以克服傳統藥物許多缺陷以及無法解決的問題。與常規藥物相比，納米藥物顆粒小、表面反應活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力強，因此，它具有許多常規藥物不具備的優點［6］：①能增大藥物溶解度和吸收利用度，減少藥物用量，減輕或消除毒副作用并節省藥物資源。②納米顆粒作為生物大分子的載體，能改善蛋白質、多肽類大分子等口服藥物的吸收和生物利用度。③納米藥物可以實現緩釋、控釋和靶向治療。目前，已有多篇文章報道，將傳統藥物納米化后，藥效大大提高，在抗腫瘤研究中顯示了充分的優越性。如紫杉醇納米顆粒能明顯減小腫瘤體積，延長動物存活時間，與等劑量的游離型紫杉醇相比，抗腫瘤活性顯著增強［7］。納米化的砒霜和雄黃與傳統劑型相比，抗腫瘤療效均明顯增強［8］。

本研究采用MTT法觀察了給予不同濃度20（S）－人參皂苷和載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在不同時間點對人宮頸癌Hela細胞的生長抑制作用。結果顯示，SPG－Rg3和SPG－Rg3－HAS－NP對宮頸癌Hela細胞均具有顯著的細胞生長抑制作用，且Hela細胞生長分別與兩組藥物的給藥濃度和時間呈一定的濃度依賴性和時間依賴性。SPG－Rg3組在80μg/ml濃度以后似已進入平臺期甚至出現曲線下行的趨勢，而SPG－Rg3－HAS－NP組的細胞生長曲線仍繼續上升，72h后于20μg/ml濃度處抑制率已超過SPG－Rg3組（P＜0.05）。提示SPGRg3－HAS－NP組藥物對Hela細胞的抑制有一定的時間延續性，表明載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球具有一定的緩釋作用。這與白蛋白分子的空間結構以及白蛋白納米微球的生物特性有很大的關系。白蛋白分子中的氨基酸以肽鍵相連，且扭曲成團裝，具網狀空隙，有利于攜帶20（S）－人參皂苷藥物，同時白蛋白由于有較低的免疫原性和可生物降解的特點，可致載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球具有緩釋藥物的特點［9］。

由于體內外環境的巨大差異，本實驗只初步檢測了20（S）－人參皂苷和載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在體外對Hela細胞的生長抑制作用的藥效作用方面是否有明顯減損，與原藥相比，載20（S）－人參皂苷白蛋白納米微球在藥物緩釋和生物利用度方面具有一定的優勢，但難以體現其更多的劑型優勢，比如載藥白蛋白納米微球在動物體內的組織滯留性以及靶器官的藥物濃度和作用時間等方面都需要在今后的體內試驗中進一步加以研究。治療。

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