液態發酵核桃餅粕的初步研究

梁 杏，趙聲蘭*，曹冠華，蔡雪梅，程祥云，和小明，陳朝銀

（1.云南中醫學院中藥學院，云南 昆明 650500；昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650500）

核桃又名胡桃、羌桃、萬歲子，系胡桃科核桃屬植物，具有補氣養血、溫腸補腎、潤肺止咳、烏發健腦等作用。核桃仁含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素E和微量元素等[1-3]。核桃仁螺旋壓榨制油后的餅粕含有豐富的蛋白質，是蛋白肽的良好原料，但目前多用于飼料和肥料。近年來的研究發現，人類攝取蛋白質經消化酶作用后，并非主要以氨基酸形式吸收，而是以肽的形式吸收[4]，某些低肽不僅能提供人體生長、發育所需的營養物質，同時具有防病治病、調節人體機能等多種生理功能[5-7]，有些沒有生物活性的蛋白質水解為多肽后會具有活性，成為生物活性肽[8]。核桃蛋白肽具有溶解度高，受pH值影響小，同時具備高濃度、低黏度等特點，與核桃蛋白相比，核桃多肽的乳化性、起泡性、吸油性等方面都更加優良，此外核桃多肽還具有較強的抗氧化能力及對超氧陰離子有一定清除作用[9-12]等。本研究采用液態發酵法，通過枯草芽孢桿菌的生長繁殖和代謝反應，將核桃餅粕中的核桃蛋白轉化成為核桃多肽，為核桃餅粕的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕：云南匯智源食品有限公司；蛋白質含量43.23%，粗脂肪9.90%，粗灰分3.62%，總糖7.56%，水分4.62%[13]。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis natto）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）購自云南省微生物研究所菌種保藏中心。

沒食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉等化學試劑均為國產分析純。

福林酚試劑：稱取20g鎢酸鈉和5.0g鉬酸鈉于圓底燒瓶中，用140mL蒸餾水溶解，加入10mL 85%濃磷酸及20mL濃鹽酸，充分混勻，小火回流10h，稍冷后加入3g硫酸鋰及15mL雙氧水，加熱沸騰（開口）至亮黃色，不帶綠色為止，冷卻，移至250mL容量瓶中，蒸餾水定容，裝入棕色瓶，于4℃條件下保存。10%福林酚試劑：取20mL福林酚試劑加水定容至200mL，現配現用。

沒食子酸對照品儲備液配制（100μg/mL）：取0.0050g沒食子酸對照品，蒸餾水溶解，定容至50mL。沒食子酸對照品工作液：用移液管分別移取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL的沒食子酸對照品儲備液于10mL容量瓶中，分別用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得質量濃度分別為 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的沒食子酸工作液。

營養瓊脂培養基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂15.0g/L。

發酵培養基：牛肉膏 2g/L，蛋白胨 3g/L，葡萄糖20g/L，檸檬酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀10g/L，氯化鈣3g/L。

1.2 儀器與設備

雷磁pHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；KDY-12型消化爐、QSY II型凱氏定氮儀：北京強盛分析儀器制造中心；L-550型低速臺式離心機、TG16-WS高速臺式離心機：長沙湘儀離心機儀器系統有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；ZHWY111B恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；UV759S型紫外-可見分光光度計：上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 含量測定

多酚含量的測定采用福林酚比色法[14-16]。蛋白質含量的測定按照GB/T5009.5—2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。游離氨基酸含量的測定采用甲醛滴定法。酸溶蛋白氮含量的測定：發酵液8500r/min離心10min，取上清液10mL，加入10%三氯乙酸溶液10mL，混合均勻，靜置3min，9500r/min離心5min，取10mL上清液測定酸溶蛋白氮的含量。多肽含量計算公式：

1.3.2 發酵培養

取14個500mL三角瓶，分別準確加入10g核桃餅粕，20g/L葡萄糖溶液20mL，75mL的生理鹽水，121℃、21min滅菌，其中7瓶接種擴大培養好的菌種，剩下7瓶作空白對照，37℃、180r/min搖床培養7d，每天取一瓶樣品和一瓶空白對照測氨基酸含量和酸溶性蛋白含量。

1.3.3 適宜菌種的選擇

測定水解圈直徑，由于測量水解圈直徑通常包含菌落直徑，為便于客觀比較，采用了水解圈直徑與菌落直徑比值，該比值越大，說明該細菌所產蛋白酶的活性越高。

1.3.4 菌種液制備

發酵培養基中分別各接5環枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌，37℃、180r/min搖床培養24h制備各實驗用菌液。

1.3.5 核桃餅粕多酚粗提物的制備

核桃餅粕用5倍量65%vol乙醇95℃回流提取1h，濾液真空旋轉蒸發濃縮、冷凍干燥即為核桃餅粕多酚粗提物。

2 結果與討論

2.1 菌種的篩選

在用瓊脂2.0g、水100mL、脫脂奶粉3g制備的培養基（pH值7.0～7.2）中挖3個小孔，3個小孔中分別加入8μL枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌的菌液，37℃恒溫培養24h后觀察菌落水解圈，測定水解圈直徑與菌落直徑的比值，結果納豆芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌未見明顯的水解圈，枯草芽孢桿菌有明顯的水解圈，其水解圈直徑與菌落直徑的比值為1.58，故選擇枯草芽孢桿菌進行接種液態發酵。

2.2 多酚對枯草芽孢桿菌菌落生長和分解蛋白質的影響

以脫脂奶粉3g、瓊脂2g、蒸餾水100mL制備培養基（pH值7.0～7.2），滅菌后倒入培養皿，分別將濃度為0.2%、0.5%、3.0%的核桃皮多酚粗提物2mL加入培養基表面，用三角棒平鋪均勻，待表面較干燥后接種枯草芽孢桿菌，同時做不加核桃多酚粗提物僅接種枯草芽孢桿菌的對照組和不加核桃皮多酚粗提物、不接種枯草芽孢桿菌的空白組，每組做二組平行實驗，37℃恒溫培養36h～72h，觀察枯草芽孢桿菌生長和對蛋白質的水解，結果分別見表1和表2。

表1 枯草芽孢桿菌的菌落直徑Table 1 Colony diameter ofB.subtilis

由表1、表2可知，隨著核桃多酚粗提物濃度的增加，枯草芽孢桿菌菌落生長受到的抑制作用增加，水解圈直徑與菌落直徑比值變小，當核桃多酚粗提物濃度達3.0%時，已經觀察不到水解圈。核桃多酚粗提物會抑制枯草芽孢桿菌生長繁殖及其對蛋白質的水解，故利用枯草芽孢桿菌發酵核桃餅粕之前，應提取核桃餅粕中的多酚物質的，以利于發酵。

2.3 核桃餅粕中多酚類物質的提取

表2 水解圈直徑與菌落直徑比值Table 2 Ratio of hydrolysis circle diameter and colony diameter

2.3.1 沒食子酸標準曲線的制備

分別精密吸取沒食子酸工作液1mL于10mL容量瓶中，加入5.0mL 10%福林酚試劑，搖勻，5min后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0mL（前后時間間隔不超過8min），混勻，加水定容，30℃避光放置反應1h，在波長765nm處測定其吸光度值。吸光度值（y）與沒食子酸濃度（x，μg/mL）的回歸方程y=0.0128x+0.0123，r=0.9991，沒食子酸在0μg/mL～50μg/mL范圍內，濃度與吸光度值呈良好線性關系。

2.3.2 提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，參考相關文獻[17]，采用L9（34）正交試驗研究提取時間、溫度和乙醇濃度對核桃餅粕中多酚類物質提取的影響。試驗因素水平見表3，每組做3次重復試驗，正交試驗結果與分析見表4，方差分析見表5。

表3 提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal test for extraction technology optimization

由表4可知，提取時間、溫度、乙醇濃度對多酚提取影響由大到小順序是C＞B＞A，即乙醇濃度＞溫度＞時間，適宜的提取條件為A3B3C1，即提取時間60min、提取溫度95℃、乙醇濃度65%vol。在此最佳條件下進行驗證試驗，多酚含量為7.22%。由表5可知，乙醇濃度對多酚含量影響顯著，其余2個因素對多酚含量影響不顯著。

2.4 枯草芽孢桿菌液態發酵核桃餅粕

2.4.1 枯草芽孢桿菌對核桃餅粕的液態發酵

將枯草芽孢桿菌按菌液：發酵培養基為3∶100的量接種核桃餅粕液體發酵培養基進行液態發酵，同時進行不接種枯草芽孢桿菌的空白試驗，每天取樣分析測定樣品組和空白組中的游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量，結果見圖1。由圖1可知，發酵0h～24h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量隨發酵時間的增加而增加，發酵24h～48h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量有所下降，發酵48h～96h，游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量隨發酵時間的增加而增加，發酵96h～168h，酸溶性蛋白質和多肽含量趨于平穩?？莶菅挎邨U菌液態發酵核桃餅粕，可較好地使其蛋白轉化為游離氨基酸和多肽，發酵時間以酸溶蛋白達最高時的拐點（96h）為宜。

表4 提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for extraction technology optimization

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results

圖1 游離氨基酸和酸溶性蛋白質含量的變化Fig.1 Variation of free amino acid and soluble protein content

2.4.2 核桃餅粕多酚對發酵的影響

圖2 核桃餅粕多酚對發酵中游離氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of walnut residue polyphenols on free amino acid content during fermentation

圖3 核桃餅粕多酚對發酵中酸溶性蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of walnut residue polyphenols on acid soluble protein content during fermentation

圖4 核桃餅粕多酚對發酵中多肽含量的影響Fig.4 Effect of walnut residue polyphenols on the content of polypeptide during fermentation

用枯草芽孢桿菌擴大培養分別對除去和不除去多酚類物質的核桃餅粕進行液態發酵，每4h取樣測定游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量，同時進行不加枯草芽孢桿菌的樣品對照試驗，結果（圖2～圖4）可知，核桃餅粕中的多酚對枯草芽孢桿菌液態發酵有一定影響，將核桃餅粕中的多酚提取除去后再進行發酵，有利于發酵，去除多酚的樣品發酵液中的游離氨基酸、酸溶性蛋白質和多肽含量均高于不去除多酚的樣品20%以上，而且去除多酚后進行發酵，酸溶蛋白達最高點的發酵時間可縮短25%以上。

3 結論

相比納豆枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌具有較強水解核桃餅粕蛋白的能力，是液態發酵核桃餅粕的適宜菌種，發酵時間以96h為宜。核桃餅粕中的多酚類物質會抑制枯草芽孢桿菌發酵核桃餅粕，且隨著多酚類物質濃度的增大，抑制作用增強，除去核桃餅粕中多酚類物質，可提高發酵液中的游離氨基酸和多肽含量20%以上，縮短發酵周期25%以上。核桃餅粕中多酚類物質適宜的提取條件為65%vol乙醇，提取溫度95℃，提取時間1h。

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