高糖狀態下心肌成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達變化的觀察

戴 斌，崔 猛，張 宏

（1.天津醫科大學總醫院內分泌科，天津300052；2.天津醫院創傷骨科，天津300211；3.天津醫科大學代謝病醫院肥胖代謝科，天津300070）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是一種獨立的、特異的糖尿病并發癥，與繼發于高血壓、冠心病或瓣膜性心臟病的病理、生理改變不完全相同。DC是由糖代謝紊亂引起的心肌細胞原發性損傷及心肌功能障礙，其臨床特征主要以左心室肥厚及心肌舒縮功能缺損為主，隨著病程的進展會出現充血性心力衰竭，是糖尿病患者致殘和致死的重要原因之一。臨床研究發現，糖尿病患者多表現為向心性心室肥厚，可伴有左心室功能受損，心臟順應性下降。除心肌細胞肥大外，心肌纖維化及間質重構亦是DC時心室舒縮功能障礙、心力衰竭的主要機制之一［1］。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～3d的SD幼鼠15只，平均體質量8.5g，購自天津醫科大學動物實驗中心。DMEM培養基購于美國Sigma公司。胎牛血清購于英國Gibco公司，胰蛋白酶購于美國Sigma公司，Vimentin波形蛋白單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。Ⅰ型前膠原羧基端肽（PⅠCP）與Ⅲ型前膠原氨基端肽（PⅢNP）ELISA試劑盒購于美國BPB公司。Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，定量PCR相關試劑購于日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將幼鼠處死后剪取心尖組織。DMEM洗，剪碎，Ⅱ型前膠元酶消化后收集上清液。加入10%胎牛血清，離心重懸細胞，于5%CO2、37℃孵箱中培養2h，吸去上清液，重新加入培養液，原代培養細胞生長成細胞單層。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1∶2比例傳代培養。經3次傳代后，已純化為心肌成纖維細胞，實驗選用3～5代細胞。行抗波形蛋白多克隆抗體免疫組織化學染色鑒定，結果為陽性。

1.2.2 試驗分組 所有細胞共分成2組。（1）高糖組：高糖培養定義為DMEM25培養基中含葡萄糖25mmol／L；（2）對照組：正常糖DMEM5.5培養基含葡萄糖5.5mmol／L。各組細胞均刺激6、12、24h后，棄去培養液，加Trizol、氯仿，離心收集細胞沉淀。抽提總RNA，逆轉錄cDNA，以預先設計好的引物進行目的基因的擴增。

1.2.3 實時熒光定量PCR測6、12、24h各組細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原的mRNA表達 Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達以逆轉錄的cDNA為模板，擴增各組細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原的mRNA，內參使用 GAPDH。α1（Ⅰ型）前膠原擴增的上游引物：5′－AGC CAC CAG CCC CTC ACT－3′；下游引物 5′－CGA GGT AGT CTT TCA GCA ACA CAG T－3′；擴增片斷長度為160bp。α1（Ⅲ型）前膠原上游引物：5′－CAA CAC CGA TGA GAT TAT G－3′；下游引物：5′－TCA GGA TTG CCG TAG C－3′；擴增片斷長度為344bp。GAPDH 上游引物：5′－GGG GTG ATG CTG GTG CTG AG－3′，下游引物5′－GAT GCA GGG ATG ATG TTC TG－3′擴增片段370bp。反應條件：逆轉錄65℃10 min，25℃5min；預變性94℃4min；循環94℃30s：50℃退火30s：72℃延伸40s；共40個循環。

1.2.4 酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測各組細胞24、48、72h 3個時間點的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達 Ⅰ與Ⅲ型膠原蛋白表達由PⅠCP與PⅢNP決定，根據ELISA試劑盒說明操作以檢測PⅠCP與PⅢCP的表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行分析。結果取均值，計量資料以±s表示。各組間均數的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組細胞Ⅰ型膠原表達比較 與對照組比較，高糖組細胞經高糖培養后Ⅰ型前膠原mRNA表達顯著上升，呈時間依賴性，培養12h后升高，差異有統計學意義（P＜0.05），24h達高峰；Ⅰ型膠原蛋白表達在24h升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），在48h升高達峰值，差異有統計學意義（P＜0.05），在72h有所降低，與對照組比較升高仍差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 兩組細胞Ⅰ型前膠原mRNA表達比較

圖2 兩組細胞Ⅰ型膠原蛋白表達比較

2.2 兩組細胞Ⅲ型膠原表達比較 與對照組比較，高糖組細胞經高糖培養后Ⅲ型前膠原mRNA表達呈時間依賴性上升，12h升高差異有統計學意義（P＜0.05），24h升高達高峰（圖3）。高糖刺激膠原的mRNA表達升高，Ⅰ型膠原mRNA升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。與對照組比較，高糖組Ⅲ型膠原蛋白表達呈時間依賴性上升，24h升高但差異無統計學意義（P＞0.05），48h明顯升高差異有統計學意義（P＜0.05），72h達高峰（圖4）。與對照組比較，48h時Ⅰ型膠原蛋白升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。

圖3 兩組細胞Ⅲ型前膠原mRNA表達比較

圖4 兩組細胞Ⅲ型膠原蛋白表達比較

3 討 論

糖尿病是一種威脅全人類健康的疾病，發病率逐年增加。而糖尿病目前已被視為冠心病的等危癥，因為糖尿病顯著升高心血管疾病的發病率和死亡率。有研究發現，糖尿病患者并發冠心病是非糖尿病患者的4倍。然而，糖尿病導致冠心病的發生是多因素、多途徑的，其具體機制目前尚未完全明確。糖尿病動物模型和臨床研究發現糖尿病心臟心肌細胞顯著肥大、細胞外基質增加、心臟纖維化和舒縮功能減退，導致心室壁僵硬度增加，呈現類似限制性心肌病樣的改變［2－5］。

心肌成纖維細胞是心臟組織中數目最多的細胞，遍布于心肌組織，包繞心肌細胞并連接細胞間質［6－7］。心肌成纖維細胞是心肌纖維化的主要效應細胞，其過度增殖，膠原分泌增加在心肌纖維化發生、發展中起著重要作用。高血糖是導致心肌纖維化及間質重構的重要因素，有研究表明，糖基化終末產物可誘導心肌成纖維細胞增殖［8－9］。高血糖可通過多種途徑促使心臟纖維化［10－12］，其機制包括暫時或持續的促進成纖維細胞增殖和增加成纖維細胞外基質的產生。其信號調節機制復雜。深入探索高糖誘導心肌纖維化的分子機制對防治糖尿病心肌病的進行性發展具有重要意義。

心肌成纖維細胞是心臟分泌膠原的主要細胞，是維持心臟生理和病理性重塑的主要調節因素［13－15］。本實驗觀察到高糖培養鼠心肌成纖維細胞，可促進Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達顯著上升，表明心肌成纖維細胞的膠原合成在轉錄和翻譯后水平進行。高糖刺激鼠心肌成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原增殖并呈時間依賴性，培養12hmRNA即升高，而蛋白在48h明顯升高，蛋白延后于mRNA水平的升高表明了反應的連續性和順序性。高糖刺激膠原mRNA表達升高，Ⅰ型膠原mRNA升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。Ⅲ型膠原蛋白表達呈時間依賴性上升，24h升高但差異無統計學意義（P＞0.05），48h明顯升高差異有統計學意義（P＜0.05），72h達高峰。48h時Ⅰ型膠原蛋白升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。

高糖促進膠原合成，從而促進纖維化。本研究證實高糖可以促進大鼠心肌成纖維細胞增殖，Ⅰ、Ⅲ膠原mRNA及蛋白表達增多，Ⅰ型膠原升高幅度較Ⅲ型膠原明顯。其具體上下游信號通路有待進一步研究。

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