幽門(mén)螺旋桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

萬(wàn)小勇，楊登元

（1.南京市市級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院消化內(nèi)科，南京210018；2.南京市市級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院普外科，南京 210018）

幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是慢性胃病（慢性胃炎、消化性潰瘍）的重要病因，Hp感染是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重危害［1－3］。Hp是一種微需氧革蘭陰性螺旋桿菌，定植于人胃黏膜上皮細(xì)胞表面，在全球人群中的感染率超過(guò)50%，某些發(fā)展中國(guó)家和不發(fā)達(dá)地區(qū)感染率超過(guò)90%［4］。

細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白 A（cytotoxin-associated protein，CagA）是由Hp相應(yīng)的CagA基因編碼產(chǎn)生的一種外膜蛋白，是Hp的重要毒力因子之一，與HP致病及相關(guān)疾病臨床嚴(yán)重程度有關(guān)［3，5］。CagA蛋白具有較強(qiáng)的抗原性，大多HP感染者外周血中可檢出CagA抗體，故其可為HP感染的特異性指標(biāo)。有研究者［6］在表達(dá)Hp CagA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中獲得了CagA致癌的直接證據(jù)，但其致癌分子機(jī)制尚不明確。

本研究從胃炎及消化性潰瘍患者胃黏膜活檢標(biāo)本中分離HP，構(gòu)建了CagA基因真核表達(dá)系統(tǒng)，建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法，并對(duì)CagA蛋白進(jìn)行分離、純化和鑒定，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、CagA蛋白功能以及致病機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

限制性?xún)?nèi)切酶Bgl 2、Xhol1、T-4DNA連接酶（Fermentas公司），DNA膠回收試劑盒、基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒（TaKaRa公司），DNA Marker和預(yù)染蛋白 Marker（Fermentas生物工程公司），一抗：鼠抗CagA多克隆抗體（abcam 公司），二抗：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司），PYL培養(yǎng)基（法國(guó)BioMerux公司），pEGFP 真 核 細(xì) 胞 表 達(dá) 載 體、Opti-MEM、DMEM-1000培養(yǎng)基（Gibco公司），基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；長(zhǎng)序列、高保真PCR試劑盒（德國(guó)羅氏公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 HP菌株的分離培養(yǎng)

胃鏡下已確定為消化性潰瘍或慢性胃炎者，用無(wú)菌活檢鉗于胃竇部大彎側(cè)取患者胃黏膜組織做快速尿素酶試驗(yàn)。尿素酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性者，將活檢的胃黏膜組織塊研碎后直接接種在PYL培養(yǎng)基表面，37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)96h，經(jīng)生化反應(yīng)（快速尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)）和血清學(xué)鑒定后，擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)菌。

1.3 Hp基因組DNA的提取

收集細(xì)菌，PBS洗滌3次，參照試劑盒使用說(shuō)明提取Hp基因組DNA，待PCR擴(kuò)增用。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GeneBank中報(bào)道的Hp CagA基因序列（AF289450.1），設(shè)計(jì)上下游引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：

引物序列下劃線部分為酶切位點(diǎn)，分別是Xhol 1（CTCGAG）及Bgl 2（AGATCT）。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為550bp左右。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增Hp CagA基因

以提取的Hp基因組DNA作為模板擴(kuò)增CagA基因，RT-PCR體系參照試劑盒使用說(shuō)明。RT-PCR反應(yīng)條件為：52℃30min，95℃變性15 min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶并回收。

1.6 重組pMD18-T-CagA質(zhì)粒的構(gòu)建

膠回收產(chǎn)物與pMD18-T Simple Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板過(guò)夜，挑選單個(gè)菌落擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-CagA質(zhì)粒。

1.7 真核表達(dá)載體pEGFP-CagA的構(gòu)建

Xhol 1和Bgl 2分別雙酶切pMD18-T-CagA與pEGFP質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后連接酶切產(chǎn)物，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的重組載體進(jìn)行基因測(cè)序分析，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-CagA。

1.8 真核表達(dá)載體pEGFP-CagA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

10%胎牛血清（FBS）的DMEM常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，37℃，5%CO2。轉(zhuǎn)染前1d收集2×106細(xì)胞接種于8mm平皿中，培養(yǎng)18～24h，使平板中細(xì)胞匯合達(dá)70%左右。將pEGFP-CagA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，步驟如下：將培養(yǎng)液換為無(wú)血清DMEM，在離心管 中 加 入 200 μL 的 Opti-MEM、10 μL Lipofectamine 2000和5μg質(zhì)粒DNA，充分混勻，室溫放置30min。加以上混合物至平皿，37℃孵育4h以上，換10%FBS的DMEM-1000培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染同時(shí)另設(shè)空白對(duì)照和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。

1.9 Western blot鑒定表達(dá)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)48h收集細(xì)胞。SDS-PAGE蛋白電泳后，將蛋白從轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉。一抗為1∶1 000鼠抗CagA多克隆抗體，二抗為1∶5 000HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。用化學(xué)發(fā)光蛋白免疫印跡法（ECL）進(jìn)行 Western Blot顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增Hp CagA基因的鑒定

CagA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在約550bp處可見(jiàn)單一特異性條帶，大小與預(yù)期的結(jié)果一致（見(jiàn)圖1）。

2.2 重組pMD18-T-CagA質(zhì)粒鑒定

通過(guò)T-A連接原理將PCR產(chǎn)物與pMD18-T Simple Vector進(jìn)行連接，產(chǎn)物pMD18-T-CagA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑4個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果全部為陽(yáng)性（2-5）（見(jiàn)圖2），取其中1個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，Xhol 1和Bgl 2雙酶切，酶切后電泳鑒定可見(jiàn)約550bp左右的目的帶（見(jiàn)圖3）。結(jié)果表明CagA基因片段正確克隆到載體pMD18-T上。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

圖2 pMD18-T-CagA基因片段的PCR鑒定

圖3 pMD18-T-CagA雙酶切鑒定

2.3 真核表達(dá)載體pEGFP-CagA鑒定

pMD18-T-CagA酶切回收后與pEGFP載體相連，將連接產(chǎn)物pEGFP-CagA轉(zhuǎn)化為大腸桿菌TDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取5個(gè)單克隆進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果4個(gè)為陽(yáng)性（2，3，5），1個(gè)為陰性（4）（見(jiàn)圖4）。取其中1個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒用Xhol 1和Bgl 2雙酶切，雙酶切后，電泳鑒定可見(jiàn)2 000bp左右的載體條帶和550bp目的條帶，大小同預(yù)計(jì)的結(jié)果相符（見(jiàn)圖5）。將質(zhì)粒送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒中的CagA基因與GenBank公布的堿基序列一致。

2.4 Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFP-CagA質(zhì)粒后的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，在分子量約為30KD位置呈現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)空載體組與空白對(duì)照組無(wú)條帶，提示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠表達(dá)CagA蛋白（見(jiàn)圖6）

圖4 質(zhì)粒pEGFP-CagA PCR鑒定

圖5 質(zhì)粒pEGFP-CagA酶切鑒定

圖6 Western印跡法檢測(cè)pEGFP-CagA在293T細(xì)胞的表達(dá)

3 討論

全球超過(guò)半數(shù)的人持續(xù)感染Hp，大量的流行病學(xué)資料［7，8］表明，胃癌發(fā)生率與Hp感染率呈正相關(guān)，Hp感染是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。CagA蛋白是Hp的重要毒力因子之一，在Hp致病機(jī)制中扮演重要角色。經(jīng)TFSS系統(tǒng)進(jìn)入人胃上皮細(xì)胞的CagA蛋白被磷酸化，并定位在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面，定植于胃上皮表面的Hp通過(guò)其特有的Ⅳ型分泌系統(tǒng)將CagA蛋白注入宿主細(xì)胞內(nèi)并引起細(xì)胞骨架的重構(gòu)，與多種胞內(nèi)蛋白相互作用，干擾細(xì)胞信息傳遞，激活Rho GTP酶、Rac l和cdc 42，活化 NF-κB，激活c-fos和c－jun等原癌基因以及促進(jìn)細(xì)胞因子和炎性因子的釋放，破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，可能導(dǎo)致細(xì)胞增生和凋亡的失衡，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少，而增生活躍，增加自發(fā)性DNA復(fù)制錯(cuò)誤的產(chǎn)生機(jī)率，同時(shí)增加內(nèi)外源性致癌因子致DNA突變的機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生［9，10］。

各國(guó)人群中Hp感染率約為50%，發(fā)展中國(guó)家超過(guò)70%，我國(guó)是Hp感染較嚴(yán)重的國(guó)家之一，且Hp菌株 CagA 的陽(yáng)性率高達(dá)90%［11－13］。CagA 作為重要的毒力基因和潛在的靶標(biāo)，已成為當(dāng)前Hp研究的重中之重，其致病的機(jī)理較為復(fù)雜，活菌及全基因組機(jī)制的研究受干擾因素較多，難以控制。本研究旨在探討體外模型中CagA蛋白的功能及其可能的致病機(jī)制。本研究從胃炎及消化性潰瘍患者胃黏膜活檢標(biāo)本中分離HP，參照genebank序列設(shè)計(jì)引物，用PCR法獲得Hp的CagA基因序列，然后將其克隆到真核表達(dá)載體pEGFP中，通過(guò)PCR擴(kuò)增、雙酶切和序列測(cè)定等技術(shù)證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建的準(zhǔn)確性，并利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，通過(guò)western-blot法證實(shí)了細(xì)胞中有特異性外源蛋白CagA的表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了Hp CagA基因真核表達(dá)載體，完成了CagA蛋白體外表達(dá)模型構(gòu)建，為后期建立穩(wěn)定表達(dá)CagA的細(xì)胞模型和對(duì)CagA蛋白功能的進(jìn)一步研究提供了良好的基礎(chǔ)。

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