羊蹄根對體外肝星狀細胞增殖的影響

盧興兵，練正秋，白莉莎

（成都市第三人民醫院，成都 610031）

肝纖維化是所有慢性肝病進展成肝硬化的共同病理基礎與必經階段，是由炎性刺激導致肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化后，合成并分泌以膠原蛋白為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積于肝所致。HSCs活化是肝纖維化發生的細胞學基礎，是各種病因肝纖維化發生的共同中心環節，一直是近年的研究熱點。由于肝纖維化在進入肝硬化前尚可逆轉，因此，開發有效的治療肝纖維化的藥物對預防慢性肝病的進一步發展十分重要［1，2］。羊蹄根為蓼科多年生草本植物羊蹄的干燥根，始見于《神農本草經》，經成分預試含蒽醌類、皂苷類、揮發油及油脂等類物質，其單味湯劑可治療咯血、吐血和衄血，臨床應用多為復方制劑［3］。本文旨在探討羊蹄根對體外HSCs增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器

DMEM培養基、DMSO和0.25%肝星狀胰蛋白酶-EDTA（均購于美國Gibco公司），肝星狀細胞株、胎牛血清（杭州四季青），MTT試劑（購于美國sigma）；thermo細胞培養箱，奧林巴斯倒置相差顯微鏡；thermo加樣器，（BIO-RAD company）酶標儀，細胞培養瓶、羊蹄根制劑（由吉林醫藥學院檢驗學院提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 將剛復蘇的HSCs接種在含10%胎牛血清、100U/mL二抗溶液（終濃度為青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）的DMEM完全培養基中，培養于5%CO237℃培養箱中。待細胞處于生長對數期并貼滿整個瓶底時，0.25%胰酶消化后傳代培養，調配細胞濃度為105/m并轉移至96孔板，每孔100μL HSCs懸液。待細胞生長穩定后同步分為對照組和羊蹄根不同劑量組A1、A2、A3，每組10個平行孔。然后，更換無血清DMEM培養基饑餓培養8h后，每孔均加入10μL轉化生長因子（TGF-β）于5%CO237℃條件下培養12h后，分別加入A1（1∶1 200）、A2（1∶1 800）和 A3（1∶2 400）3種不同濃度的羊蹄根溶液10μL誘導48h。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖 待細胞貼壁同步誘導48h后，每孔加入MTT 20μL培養4h后，棄上層培養基后每孔加入150μL DMSO液，置于振蕩器上充分震蕩10min，通過酶標儀570nm波長測取每孔吸光度（OD）值。計算藥物對細胞增殖的抑制率IE（%）＝（1－ODn/OD0）×100%，其中IE表示藥物對細胞增殖抑制率，OD0表示對照組細胞的吸光度值，ODn表示某濃度下的吸光度值。

1.2.3 相差顯微鏡觀察細胞形態學變化 在倒置相差顯微鏡下觀察對照組、羊蹄根不同劑量組處理前后的細胞形態學變化。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗，實驗結果用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 MTT檢測羊蹄根對HSCs的增殖情況

與對照組比較，羊蹄根組OD值顯著下降（P＜0.05），各劑量對HSCs的增殖均有顯著抑制作用（P＜0.05），并且高劑量組（A1）與中（A2）、低（A3）劑量組相比OD值差異有統計學意義（P＜0.01），但中劑量組A2與低劑量組A3相比OD值之間差異無統計學意義（P＞0.05），隨著羊蹄根濃度的增加，HSCs增殖抑制率也逐漸升高，3組抑制率分別為69.36%、32.01%和29.14%（見表1）。

表1 羊蹄根對體外HSCs增殖的影響（±s）

表1 羊蹄根對體外HSCs增殖的影響（±s）

與對照組相比，＊P＜0.05；與高劑量組A1相比，＃P＜0.01

組別 n IE/% OD值10 - 0.731±0.117 A1（1∶1 200） 10 69.36 0.224±0.037＊A2（1∶1 800） 10 32.01 0.497±0.031＊＃A3（1∶2 400） 10 29.14 0.518±0.033＊＃對照組

2.2 羊蹄根對HSCs的細胞形態變化

經過復蘇、傳代后，HSCs體外生長穩定，鏡下可見細胞典型星芒狀及梭形，少數細胞間有偽足相互連接，偶見細胞融合成片，細胞結構輪廓清晰、可見胞核（見圖1）。加入TGF-β刺激后，鏡下可見細胞密度增加，細胞排列紊亂，細胞之間相互連接并大量融合，細胞輪廓模糊、胞內顆粒樣物質增多，隨著時間的推移，HSCs融合成片聚集、結構完全破壞，整個背景臟亂（見圖2、3）。加入羊蹄根藥物干預后，細胞形態發生了顯著變化：細胞由典型的星形變成了橢圓形或梭形，細胞密度明顯減少，細胞體積減小，細胞排列整齊、結構完整，細胞之間偽足連接少見，融合基本消失，隨著羊蹄根濃度的增加，HSCs細胞形態呈現差異（見圖4、5、6）。

3 討論

目前，世界范圍內每年約有0.5萬～1.2萬人因感染乙肝病毒而死亡［4］。我國是乙肝高發區，由于肝炎病毒早期臨床表現及癥狀不明顯，當就診時卻已經發展為慢性肝炎，加上地區醫療條件和自身的不重視而未得到及時有效的診斷治療，在各種慢性肝病進展中，肝內纖維生成與降解失衡，導致過量的ECM在肝內沉積，最終肝細胞逐漸纖維化，嚴重時發展為肝硬化、肝癌［5］，因此肝纖維化具有較高的致病率和病死率［6］。研究［7］表明肝纖維化是肝組織對慢性損傷的修復反應，是大多數慢性肝病共同的病理特征，目前多數學者認為肝纖維化進程可逆，預防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環節。HSCs活化是肝纖維化形成的重要因素之一，由于人肝纖維化細胞的獲取困難，大鼠HSCs與人HSCs在生長習性、形態及結構上相似度很高，細胞株穩定性好，適合長期傳代培養，加之在肝纖維化發生過程中，TGF-β起重要調節促進作用［8］，通過加入 TGF－β來刺激HSCs活化合成大量的ECM，激活的HSCs自身也能合成、分泌TGF－β。為此，本組實驗采用大鼠HSCs細胞株復蘇、傳代后，在TGF－β刺激下最終成為羊蹄根對HSCs增殖影響的理想細胞模型。目前，有關中藥抗纖維化治療的研究很多，也取得了一定成績，但有關羊蹄根中藥對抗纖維化方向的研究卻很少。

圖1 對照組實驗前 圖2 TGF-β刺激后 圖3 對照組實驗后 圖4 A1組（1∶1 200） 圖5 A2組（1∶1 800） 圖6A3組（1∶2 400）

本研究通過體外復蘇、傳代培養HSCs細胞株后，加入不同濃度的羊蹄根進行干預。與對照組相比，羊蹄根實驗組能夠有效抑制HSCs增殖，逆轉肝細胞纖維化，具有一定的抗纖維化療效。不同濃度梯度的羊蹄根對HSCs增殖抑制效果也有差異，高劑量組（A1）與中（A2）、低（A3）劑量組相比 OD值差異有統計學意義（P＜0.01），而中劑量組A2與低劑量組A3之間的抑制率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。同時鏡下觀察A1組可見：細胞由之前的星形、梭形轉變成了橢圓形，凋亡細胞增多，活細胞數目顯著減少，有效抑制了HSCs增殖且抑制率高達69.36%。隨著羊蹄根濃度的降低，A2、A3組相比對照組而言，HSCs增殖抑制率差異有統計學意義（P＜0.05），抑制率分別為32.01%和29.14%，HSCs形態也發生了顯著逆轉，但干預效果不及高劑量A1組。總體說明肝細胞纖維化得到有效逆轉，延緩了HSCs纖維化的進一步惡化。

本研究結果表明：羊蹄根對HSCs增殖具有顯著的抑制作用，并且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用也在增強，抑制率也相應升高，有效逆轉了HSCs纖維化。本實驗不足之處在于未能探討出羊蹄根藥物抑制HSCs增殖的具體作用機制，其藥理治療機制還有待于進一步探討研究，以便為以后羊蹄根的臨床治療奠定基礎。

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［3］馬健康，劉哲，雷鈞濤，等.中藥羊蹄根的化學成分研究［J］.吉林醫藥學院學報，2011，32（3）：133-134.

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［6］Voiculescu M，Winkler RE，Moscovici M，etal.Chemotherapies and targeted therapies in advanced hepatocellular carcinoma：from laboratory to clinic［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2008，17（3）：315-322.

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［8］賈杰，梁永紅.轉化生長因子β與肝纖維化的研究進展［J］.醫學綜述，2008，14（21）：3225-3226.