黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒所致病毒性心肌炎小鼠急性期心肌組織連接蛋白43mRNA表達的影響

于影，馬奎影，侯春霞，柳文清，趙明

（內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科，通遼 028000）

心律失常是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）主要的臨床表現(xiàn)之一，尤其是各種室性心律失常。縫隙連接是相鄰細胞間的跨膜通道，允許小分子物質(zhì)如離子及第二信使通過，成為相鄰細胞間物質(zhì)交換及信號傳導(dǎo)最直接的方式。連接蛋白43（connexin43，Cx43）是心室縫隙連接的主要構(gòu)成成分，其分布及功能的改變對于縫隙連接的活性有重要影響［1，2］。研 究［3－5］發(fā)現(xiàn)，急性 VMC 小 鼠 心 肌 組織中Cx43表達明顯減少。黃芪總黃酮（totalflavonoids of astragalus，TFA）是從豆科類植物黃芪中分離出來的有效活性成分［6］，研究［7］發(fā)現(xiàn)TFA可顯著降低VMC小鼠心律失常發(fā)生率，但TFA對Cx43mRNA作用還未見報道。故本實驗通過觀察TFA對實驗性小鼠柯薩奇B3病毒（coxsackie virus B3，CVB3）所致 VMC 心肌 Cx43 mRNA的影響，來探討它的療效機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實驗動物：新生BALB/c小鼠，二級動物，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心提供。2）TFA由內(nèi)蒙古民族大學有機化學實驗室提供，分別按10 mg·L－1、20mg·L－1和40mg·L－1加蒸餾水制備成不同濃度溶液備用。3）病毒：CVB3和 Woodruf親心肌株。

1.2 CVB3及實驗性小鼠CVB3所致VMC模型制備

1.2.1 病毒擴增 按CVB3標準培養(yǎng)方法，經(jīng)HeLa細胞傳代生長3代，收集所有細胞懸液，3 000 r/min離心10min，取上清液測病毒濃度為108 PFU/mL（空斑形成單位），分裝后，-30℃保存，以備接種BALB/c小鼠。

1.2.2 實驗性小鼠CVB3所致VMC模型 病毒感染組與TFA組腹腔內(nèi)無菌注射含0.1mL 50倍半數(shù)組織細胞感染量（50TCID50）CVB3，正常對照組不注射CVB3。

1.3 實驗分組及實驗數(shù)據(jù)的采集和處理

將4周齡體質(zhì)量為13～15g雄性BALB/c小鼠125只隨機分為5組（n＝25），分別為正常對照組，病毒感染組，TFA高、中、低劑量組，根據(jù)已發(fā)表文獻及本項目前期實驗，經(jīng)過人鼠折算，TFA低劑量組設(shè)定為TFA 10mg·L－1，中劑量組設(shè)定為TFA 20mg·L－1，高劑量組設(shè)定為 TFA 40mg·L－1。TFA低劑量組每日 TFA（10mg·L－1）灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14d；TFA 中劑量組每日TFA（20mg·L－1）灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14 d；TFA高劑量組每日 TFA（40mg·L－1）灌胃，0.2 mL/次，2次/d，共14d；病毒感染組及正常對照組每日生理鹽水灌胃，0.2mL/次，2次/d，共14d。

1.4 一般狀況觀察

觀察動物的精神狀況、飲食、活動、大小便、皮毛色澤形態(tài)及死亡數(shù)等。

1.5 病理取材及切片制作

病毒感染及給藥后第14天，各組分別隨機取15只或剩余小鼠，脫頸椎處死后，立即沿腹中線剪開。在無菌狀態(tài)下將小鼠左肋剪開，暴露心臟，用眼科剪子將心臟取出。將上1/3心臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。無菌取出心肌切片，脫蠟、二甲苯透明，進行HE常規(guī)染色及免疫組織化學染色，于光鏡下觀察病理變化。

1.6 使用real-time PCR技術(shù)比較各組心肌組織Cx43mRNA的水平

取50mg小鼠心肌組織Trizol法（Invitrogen公司）提取心肌總RNA，紫外分光光度計測吸光度值，計算RNA濃度，瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京博奧森公司）進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)具體引物序列如下：上游引物：GTTCCACCACTTTGGCGTGC， 下 游 引 物：CAGGTGTAGACCGCACTCAG（上下游引物從左至右是5＇——3＇）。將含有目的擴增片段的質(zhì)粒DNA稀釋至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103copies/UL，使用實時PCR儀測定定量曲線和標準曲線。比較正常心肌細胞、病毒感染心肌細胞和TFA各劑量組心肌細胞Cx43mRNA的水平，觀察TFA對病毒感染心肌細胞Cx43mRNA的作用。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，變量間的相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況

正常對照組小鼠活動自如，無1例死亡。TFA各治療組小鼠的一般情況好于病毒感染組。病毒感染組小鼠在接種0.1mL 50倍半數(shù)組織細胞感染量（50TCID50）CVB3后第3天，出現(xiàn)明顯的活動減少，精神不佳，毛蜷縮無光澤，對刺激反應(yīng)遲鈍，進食、進水量減少，第5天出現(xiàn)死亡，死亡高峰在第7～9天。TFA各組小鼠死亡時間推遲到第10天開始死亡。

2.2 病理學改變

2.2.1 心臟大體改變 正常對照組小鼠心臟外觀無明顯改變。病毒感染組病變最嚴重，每只小鼠心外膜均可見大面積的黃白色斑點，心外膜下淤血。各治療組情況均好于病毒感染組，其中TFA高劑量組小鼠心外膜偶見黃白色斑點，心外膜下無淤血。2.2.2 光鏡觀察 小鼠部分心臟用10%的甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察小鼠心肌的病理變化。HE染色結(jié)果：正常對照組小鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，細胞質(zhì)豐富均勻，嗜酸性，被伊紅染成淡粉紅色，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，嗜堿性，被蘇木精染成藍色，核仁清晰，未見心肌纖維變性壞死等病理性改變。CVB3感染后各組均出現(xiàn)了不同程度的病理學改變，病毒感染組病理改變明顯，可見心肌纖維排列紊亂，部分心肌細胞質(zhì)被伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔明顯增寬，間質(zhì)明顯水腫，可見少量淋巴細胞浸潤。TFA高劑量組小鼠心臟出現(xiàn)輕微改變，心肌纖維排列尚可，結(jié)構(gòu)清晰，細胞質(zhì)豐富均勻被伊紅染成淡粉紅色，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞中央被蘇木精染成藍色，核仁清晰，偶見心肌細胞質(zhì)被伊紅染成深粉紅色，細胞核固縮變性，核仁消失，心肌纖維間隔略增寬，間質(zhì)輕度水腫，偶見淋巴細胞浸潤（見圖1）。

圖1 A：病毒感染組心肌纖維排列紊亂，可見淋巴細胞浸潤（HE×200）；B：TFA高劑量組心肌纖維排列尚可，結(jié)構(gòu)清晰，偶見淋巴細胞浸潤（HE×200）

2.2.3 各組心室肌組織Cx43mRNA的水平比較

與正常對照組相比，病毒感染組Cx43mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與病毒感染組相比較，TFA各組Cx43mRNA表達均增多，尤其是TFA高劑量Cx43mRNA表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 TFA對VMC小鼠心肌組織Cx43 mRNA表達的影響

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)惡性室性心律失常發(fā)生機制與心肌電重構(gòu)密切相關(guān)，而心肌電重構(gòu)不僅包括細胞膜離子通道的變化，也包括細胞間縫隙連接的改變，甚至在某些情況下后者顯得更為重要。Cx43作為心肌細胞縫隙連接的主要連接蛋白，對心肌電生理重構(gòu)的影響至關(guān)重要。研究［8］表明，細胞間電偶聯(lián)障礙是心律失常發(fā)生的重要原因。VMC發(fā)病過程中有多種細胞因子產(chǎn)生和分泌，它們形成了一個細胞因子網(wǎng)絡(luò)參與的免疫和炎癥反應(yīng)，可直接或間接損傷心肌的結(jié)構(gòu)和功能［4］。蔡少華等［5］研究發(fā)現(xiàn)Cx43在正常小鼠心肌閏盤中分布均勻，VMC時Cx43的分布面積和密度明顯減弱甚至陰性，VMC小鼠較正常小鼠出現(xiàn)較明顯的心律失常。總之，VMC時Cx43表達明顯減少，連接蛋白合成減少是VMC并發(fā)心律失常的重要原因。

TFA是從蒙古黃芪中分離的抗氧化清除自由基的主要活性成分，TFA中主要含有6種單體化合物，分別是β－谷甾醇、芒柄花素、毛蕊異黃酮、β－谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷［6］，其中4種為異黃酮類化合物。系列研究［7，8］表明，TFA對VMC并發(fā)心律失常具有保護性作用，可減少心律失常發(fā)生，但TFA對VMC并發(fā)心律失常發(fā)揮作用的機制尚未完全闡明。本研究觀察到VMC心肌炎小鼠急性期心肌組織Cx43mRNA表達下降，TFA能明顯提高CVB3所致VMC小鼠急性期心肌組織Cx43mRNA表達，這一結(jié)果有助于闡明TFA減少VMC并發(fā)心律失常的作用機制。

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