他克莫司對(duì)小鼠髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞成熟及抗原呈遞的干預(yù)作用研究

周艷，楊淑霞，唐海明，楊佩，鄒強(qiáng)，王衍堂＊

（1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，成都 610041；2.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，成都 610083）

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs），按成熟狀態(tài)分為成熟 DCs（mature DCs，mDCs）和 未 成 熟 DCs（immature DCs，imDCs）［1，2］。mDCs能有效激活幼稚 T 細(xì)胞（na¨Ive T cells），啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。imDCs則具有較強(qiáng)的吞噬及遷移能力，但因其僅表達(dá)低水平的MHC分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子，imDCs不能有效激活幼稚T細(xì)胞，反而誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受。鑒于DCs的表型和功能具有可塑性，可通過(guò)人工干預(yù)控制DCs的分化成熟，進(jìn)而間接調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。這種干預(yù)獲得的imDCs在誘導(dǎo)移植免疫耐受，治療自身免疫性疾病以及變態(tài)反應(yīng)等方面已經(jīng)取得初步的進(jìn)展，因此其又被稱(chēng)為致 耐 受 DCs（tolerogenic dendritic cells，Tol DCs）［3-5］。

他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）是一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)FK506結(jié)合蛋白（FKBP）專(zhuān)一性結(jié)合形成FK506-FKBP復(fù)合物，進(jìn)而抑制鈣神經(jīng)素（calcineurin）的活性，調(diào)控T、B淋巴細(xì)胞的活化、增殖以及炎性細(xì)胞因子的分泌等［6］。臨床實(shí)驗(yàn)［7］表明，F(xiàn)K506在器官移植以及自身免疫性疾病的治療中發(fā)揮著積極的作用。但FK506是否會(huì)影響小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BM-DCs）的成熟分化以及抗原呈遞功能，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)觀察比較FK506處理后的imDCs，在經(jīng)LPS誘導(dǎo)成熟后（FK-DCs）的表面分子標(biāo)志以及功能與未經(jīng)FK506處理的DCs是否存在差異，探討FK506是否可以誘導(dǎo)小鼠BM-DCs的免疫耐受，從而有助于了解FK506治療自身免疫性疾病以及抑制移植排異反應(yīng)的免疫藥理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6及BALB/c小鼠均購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心SPF動(dòng)物房。1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 rmGM-CSF及rmIL-4購(gòu)自美國(guó)Perprotech公司；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；FITC標(biāo)記的抗小鼠CD40mAb，PE標(biāo)記的抗小鼠CD80mAb，APC/Cy7標(biāo)記的抗小鼠CD86 mAb，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠MHC II mAb及相應(yīng)的同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；小鼠IL-12、IL-6及TNFα購(gòu)自美國(guó)Perprotech公司；CFSE細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BM-DCs分離培養(yǎng)及藥物干預(yù) 取6～8周齡C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡5～10min，無(wú)菌狀態(tài)下取出脛骨和股骨，浸泡于含1%胎牛血清的PBS緩沖液中。剪刀剪掉骨兩端，用1mL注射器吸取PBS緩沖液刺入骨髓腔反復(fù)沖洗，將骨髓沖洗入另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞懸液，離心（300g/min，5min），棄上清，PBS洗滌后搜集細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于100mm平皿（細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL），加入細(xì)胞因子rmGM-CSF 20ng/mL，rmIL-4 10ng/mL，37 ℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。隔日半量換液，去除未貼壁細(xì)胞及細(xì)胞碎片，并補(bǔ)充細(xì)胞因子。培養(yǎng)至第7天，輕輕吹打平皿，收獲輕微貼壁及懸浮的細(xì)胞，離心搜集，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，重新接種于24孔培養(yǎng)板（細(xì)胞密度1×106個(gè)/mL），獲得imDCs。加入100ng/mL的LPS刺激24h后，即為成熟BM-DCs。FK506在LPS刺激前24h加入，設(shè)2個(gè)組，分別為vehicle組和FK506組。

1.2.2 BM-DCs形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）觀察imDCs、mDCs和FK-DCs細(xì)胞形態(tài)特征。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)BM-DCs表面分子標(biāo)志 搜集第8天DCs、PBS緩沖液洗滌重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/100μL，每組設(shè)3復(fù)孔，加入CD80、CD86、CD40和 MHC II的熒光抗體標(biāo)記，4℃孵育30min，PBS洗滌后重懸于300μL PBS緩沖液，以相同熒光標(biāo)記的同型IgG抗體為對(duì)照，流式細(xì)胞儀（美國(guó)Bd公司）上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)BM-DCs培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá) 搜集mDCs培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-12、IL-6及TNFα的表達(dá)水平，每組設(shè)3復(fù)孔。1.2.5 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) CFSE細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒檢測(cè)FK506對(duì)mDCs刺激同種異型的T細(xì)胞增殖的影響。無(wú)菌條件下取BALB/c小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。注入尼龍毛柱（日本和光公司），37℃，5%CO2孵箱孵育1h，得到純化的T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL細(xì)胞，加入工作濃度為2μM的CFSE溶液，37℃孵育10min，定時(shí)混勻細(xì)胞懸液。用等量的含5%FBS的PBS緩沖液中止，離心去上清，PBS洗滌細(xì)胞離心去上清，重復(fù)兩次。離心重懸后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種于96孔U型底培養(yǎng)板。搜集培養(yǎng)第8天的mDCs，離心重懸后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，加入絲裂霉素C（25ng/mL）滅活，作為刺激細(xì)胞。將刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞按不同比例（1∶100、1∶30和1∶10）混合培養(yǎng)于96孔板，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)72h。離心搜集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FK-DCs的形態(tài)

光鏡下見(jiàn)培養(yǎng)第8天細(xì)胞，mDCs組貼壁生長(zhǎng)呈樹(shù)突狀，呈梭形及不規(guī)則形，F(xiàn)K506組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變。

2.2 FK-DCs的分子表型檢測(cè)

BM-DCs各組 CD80、CD86、CD40和 MHC II表達(dá)（見(jiàn)表1）。與vehicle組相比，F(xiàn)K506組mDCs CD80、CD86、CD40和MHC II表達(dá)均有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FK-DCs表面分子標(biāo)志（±s，n＝6）

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FK-DCs表面分子標(biāo)志（±s，n＝6）

與imDCs組比較，aP＜0.05；與 mDCs（vehicle）組比較，b P＜0.05

MHC II＋/%CD80＋/% CD86＋/% CD40＋/%imDCs 68.2±2.1 68.8±5.7 24.4±4.8 48.6±5.6 mDCs（vehicle） 98.4±1.7a99.3±2.4a94.7±0.9a72.4±3.5a FK-DCs 79.1±3.5b 82.8±4.6b 79.3±3.7b 54.5±2.9b

2.3 FK-DCs分泌的細(xì)胞因子測(cè)定

mDCs各組培養(yǎng)上清中BM-DCs各組CD80、CD86、CD40和MHC II的表達(dá)水平（見(jiàn)表2）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，與vehicle組相比，F(xiàn)K506組 mDCs IL-12、IL-6及 TNFα表達(dá)水平有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 ELISA檢測(cè)FK-DCs分泌炎性細(xì)胞因子（±s，n＝6）

表2 ELISA檢測(cè)FK-DCs分泌炎性細(xì)胞因子（±s，n＝6）

與 mDCs（vehicle）組比較，aP＜0.05

IL-12/（pg/mL） IL-6/（pg/mL） TNFα/（pg/mL）mDCs（vehicle） 150.45±19.85 1 680.66±152.19 5 214.23±301.21 FK-DCs 65.27± 9.56a682.33± 89.74a3 829.17±259.21a

2.4 FK-DCs刺激同種異型T細(xì)胞增殖能力的測(cè)定

C57BL/6小鼠的 mDCs與BALB/c的脾臟T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（見(jiàn)表3）。應(yīng)用CFSE活細(xì)胞標(biāo)記法，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，與vehicle組相比，F(xiàn)K506組兩個(gè)比例（1∶10及1∶30）的mDCs刺激同種異型T細(xì)胞增殖水平有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

DCs是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能直接活化幼稚T細(xì)胞的APCs，其在誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答或免疫耐受的過(guò)程中發(fā)揮了十分重要的作用［2］。DCs的表型、成熟度和功能的異質(zhì)性是平衡免疫反應(yīng)和免疫耐受的重要因素。mDCs表達(dá)高水平的共刺激分子，分泌 T細(xì)胞刺激因子（如IL-12、IL-15和IL-18等），選擇激活相應(yīng)的受者T細(xì)胞，從而誘發(fā)免疫反應(yīng)。imDCs表達(dá)低水平的共刺激分子，通過(guò)T細(xì)胞無(wú)能、免疫偏離、T細(xì)胞凋亡或者誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生等誘導(dǎo)特異性免疫耐受［5］。因此，建立大量獲取imDCs的有效方法無(wú)疑是Tol DCs臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。目前常用的獲取Tol DCs的策略主要有免疫抑制劑類(lèi)藥物誘導(dǎo)、表達(dá)細(xì)胞凋亡分子、建立細(xì)胞因子培養(yǎng)體系、基因工程技術(shù)等［8］。盡管誘導(dǎo)Tol DCs的方法較多，在試驗(yàn)研究中Tol DCs亦顯示出巨大的應(yīng)用前景，但Tol DCs真正應(yīng)用于臨床，其誘導(dǎo)手段還需要解決以下問(wèn)題：1）穩(wěn)定確切、經(jīng)濟(jì)高效；2）無(wú)或低毒副作用以及致畸致癌致突變作用；3）可控性良好，具有良好的優(yōu)化提高潛力。而目前已應(yīng)用于臨床的某些免疫抑制類(lèi)藥物，如阿司匹林、N-乙酰半胱氨酸、環(huán)孢素A或地塞米松等均被證實(shí)可以抑制DCs分化成熟，發(fā)揮免疫耐受誘導(dǎo)的藥理作用。但是以上藥物誘導(dǎo)Tol DCs特異性較差，毒副反應(yīng)顯著，限制了其在該臨床方向上的研究，尤其在解決自身免疫問(wèn)題上的長(zhǎng)期應(yīng)用。

表3 CFSE試劑盒檢測(cè)FK-DCs刺激同種異型T細(xì)胞增殖（±s，n＝6）

表3 CFSE試劑盒檢測(cè)FK-DCs刺激同種異型T細(xì)胞增殖（±s，n＝6）

與imDCs組比較，aP＜0.05；與mDCs（vehicle）組比較，b P＜0.05

mDCs∶na¨Ive T cells 1∶100 1∶30 1∶10 imDCs 2.5±0.2 5.5±0.9 12.3±1.3 mDCs（vehicle） 15.0±1.9a39.9±3.4a48.8±2.0a FK-DCs 7.1±1.8b 16.8±1.2b 23.9±2.1b

FK506是一種新型強(qiáng)效免疫抑制性大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，對(duì)T細(xì)胞有選擇性抑制作用。FK506直接作用于T細(xì)胞時(shí)，與親免蛋白FKBP結(jié)合形成FK506-FKBP復(fù)合物，進(jìn)而抑制鈣神經(jīng)素（calcineurin）的活性，并降低活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor of activated T-cells，NF-AT）的去磷酸化水平，下調(diào)的PNF-AT則直接影響IL-2等炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄［6］。而FK506還可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）活性［9］，而 NF－κB又參與調(diào)控DCs表面的 MHC II以及CD40、CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)［10］。因此推測(cè)，F(xiàn)K506可能會(huì)通過(guò)干預(yù)DCs成熟及抗原呈遞，間接調(diào)控T細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，F(xiàn)K506在體外可以有效抑制LPS誘導(dǎo)成熟的小鼠骨髓來(lái)源DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC II分子的表達(dá)，下調(diào)成熟BMDCs IL-12、IL-6及 TNFα炎性細(xì)胞因子的分泌水平，降低成熟BM-DCs刺激同種異型幼稚T細(xì)胞增殖的能力。因此，F(xiàn)K506在體外可以成功誘導(dǎo)Tol DCs，深入研究藥物（免疫抑制劑）修飾的Tol DCs以及與T細(xì)胞反應(yīng)的相互作用關(guān)系將對(duì)進(jìn)一步干預(yù)自身免疫性疾病以及誘導(dǎo)移植免疫耐受提供新的解決思路和臨床治療方向。

［1］Ardavín C.Origin，precursors and differentiation of mouse dendritic cells［J］.Nature Reviews Immunology，2003，3（7）：582-591.

［2］Reizis B，Bunin A，Ghosh HS，etal.Plasmacytoid dendritic cells：recent progress and open questions［J］.Annual Review of Immunology，2011，29：163-183.

［3］Moser M.Dendritic cells in immunity and tolerance-do they display opposite functions？［J］.Immunity，2003，19（1）：5-8.

［4］Reis e Sousa C.Dendritic cells in a mature age［J］.Nature Reviews Immunology，2006，6（6）：476-483.

［5］Minton K.Dendritic cells：Choosing the right presentation［J］.Nature Reviews Immunology，2011，11（12）：804-805.

［6］Abou-Jaoude MM，Najm R，Shaheen J，etal.Tacrolimus（FK506）versus cyclosporine microemulsion（neoral）as maintenance immunosuppression therapy in kidney transplant recipients［J］.Transplantation Proceedings，2005，37（7）：3025-3028.

［7］Rath T.Tacrolimus in transplant rejection［J］.Expert Opinion on Pharmacotherapy，2013，14（1）：115-122.

［8］Buonocore S，F(xiàn)lamand V，Goldman M，etal.Bone marrowderived immature dendritic cells prime in vivo alloreactive T cells for interleukin-4-dependent rejection of major histocompatibility complex class II antigen-disparate cardiac allograft［J］.Transplantation，2003，75（3）：407-413.

［9］Du S，Hiramatsu N，Hayakawa K，etal.Suppression of NF-kappaB by cyclosporin a and tacrolimus（FK506）via induction of the C/EBP family：implicationfor unfolded protein response［J］.J Immunol，2009，182（11）：7201-7211.

［10］Kim GY，Kim KH，Lee SH，etal.Curcumin inhibits immunostimulatory function of dendritic cells：MAPKs and translocation of NF-kappa B aspotential targets ［J］.J Immunol，2005，174（12）：8116-8124.