氟尿嘧啶緩釋劑植入對人結直腸癌裸鼠移植瘤生長抑制的觀察＊

李 弘，顏麗萍，石曉萍

（廣西壯族自治區桂林市第二人民醫院消化內科 541001）

氟尿嘧啶至今仍是結直腸癌化療的首選用藥，其對結直腸癌有著確切的抑制作用。新型植入用緩釋氟尿嘧啶是長效緩釋抗腫瘤制劑，用其治療惡性實體腫瘤對腫瘤預后有相當大的改善，其優勢在臨床已有相關報道［1－3］。本研究旨在觀察氟尿嘧啶緩釋劑對裸鼠結直腸癌（colorectal cancer，CRC）移植瘤的抑制效果，以及驗證其在抗結直腸癌方面的優勢，以期能夠進一步指導臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB／c SPF級裸鼠32只，雌性15只，雄性17只，4周齡，體質量18～20g，購于桂林醫學院動物實驗中心，批號SCXK桂2007－0001；LoVo細胞系購于廣西醫科大學。

1.2 試劑 RPMI－1640培養基及胎牛血清（Hyclone公司）；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－3（cysteinyl aspartate spe－clflc protease－3，caspase－3）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；5－氟尿嘧啶（5－FU）注射液（25mg／mL，上海旭東海普藥業有限公司）；氟尿嘧啶緩釋制劑（蕪湖中人科技有限公司，批號20010826，每瓶100mg）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立 細胞復蘇、培養、傳代，于細胞對數期收集細胞，做成濃度為1.5×107的細胞懸液，裸鼠右前肢腋下注射0.2mL細胞懸液（細胞濃度為3.0×106個／只），10d左右腫瘤長至直徑約5mm為致瘤成功，將其分為A組：磷酸鹽緩沖液（PBS）尾靜脈注射組8只；B組：5－FU尾靜脈注射組8只；C組：5－FU瘤內注射組8只；D組：氟尿嘧啶緩釋劑植入組8只。于致瘤成功后5、10、15d給予A組PBS 0.1mL、B組5－FU（100mg／kg）、C組瘤內5－FU（100mg／kg）相應處理，每次分3次給藥，D組僅在成瘤后5d植入氟尿嘧啶緩釋劑（100mg／kg）。藥物干預15d后，處死裸鼠測定瘤體大小［測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b），瘤體體積（V）＝0.5a×b2］、腫瘤質量。抑瘤率＝［1－實驗組平均腫瘤質量（B、C、D組為實驗組）／A組平均腫瘤質量×100%］，瘤體甲醛固定，石蠟包埋，常規HE染色后免疫組化檢測caspase－3。

1.3.2 免疫組化及其結果判定

1.3.2.1 免疫組化法檢測caspase－3蛋白的表達水平 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min；對組織抗原進行修復；每張切片加1滴或50μL 13%H2O2，室溫下孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶。PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加1滴或30μL的caspase抗體（1∶100稀釋在0.01mol／mL PBS中），室溫下孵育30 min或4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加1滴或30μL即用型MaxvisionTM快捷免疫組化試劑，室溫下孵育10～15min，PBS沖洗3次，每次3min；除去PBS液，每張切片滴加2滴或100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5min；自來水沖洗，蘇木精復染，PBS或自來水沖洗反藍，經過梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。37℃水浴箱孵育40min，PBS沖洗，干燥后鏡檢計數。

1.3.2.2 免疫組化結果判定 caspase－3蛋白陽性染色以細胞質呈黃色至棕黃色為主。在400倍鏡下的染色最強區域中，每張組織切片選10個視野，使用目鏡網格微尺計數1 000個細胞，陽性細胞率＝陽性細胞數／腫瘤細胞數×100%。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）、多個均數之間兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1 移植瘤體生長情況、腫瘤質量及抑瘤率 32只動物均在10d左右成瘤，成瘤率100%。D組與A、B、C組30d后腫瘤體積比較差異均有統計學意義（P＜0.05，F＝27.01），D組與A、B、C組腫瘤質量比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；D組抑瘤率較A組明顯升高，見表1。

表1 各組caspase－3的表達以及腫瘤質量及抑瘤率（±s）

表1 各組caspase－3的表達以及腫瘤質量及抑瘤率（±s）

▲：P＜0.05，與A組比較；＊：P＜0.05，與B組比較；＃：P＜0.05，與C組比較；－：表示此項無數據。

組別 caspase－3（%）瘤體體積（mm3）腫瘤質量（mg）抑瘤率（%）82.3 A 6.75±1.66 3 672±808 2.88±0.22 －B 21.13±3.67 2 421±467 2.31±0.21 19.8 C 48.50±6.62 1 663±692 1.36±0.25 52.8 D 72.88±4.51▲ 951±501＊ 0.51±0.11＃

2.2 HE染色結果 A組腫瘤細胞腺管形成、散在少量凋亡、有片狀壞死；腫瘤組織侵襲到脂肪、肌層組織。B組腫瘤細胞異型性明顯，惡性程度高，腺管狀結構不明顯，小區腫瘤細胞有小片凋亡，有小片出血壞死；腫瘤組織有局部侵襲到脂肪組織。C組腫瘤細胞異型性明顯，腺管樣結構不明顯，小區腫瘤細胞片狀凋亡，可見出血壞死灶；腫瘤邊界清楚，未見明顯侵襲。D組腫瘤細胞異型性不明顯，腺管狀結構不明顯，小區腫瘤細胞凋亡明顯，僅有少量壞死，腫瘤組織邊界清晰，未見侵襲脂肪及肌層組織，生長緩慢（圖1）。

2.3 caspase－3免疫組化結果 caspase－3的表達 A、B、C、D組是呈現逐漸上升的趨勢（圖2）。

圖1 各組HE染色結果（×400）

圖2 各組caspase－3的表達情況（×400）

3 討 論

CRC是近年來發病率上升最快的消化道惡性腫瘤之一，其病死率也逐步上升［4］。CRC發病率在全世界位于肺癌、胃癌、乳腺癌之后居惡性腫瘤第4位，其病死率居第3位。在腫瘤的治療方面，手術為主要方法，但放化療對預后及防止復發十分重要。氟尿嘧啶一直是CRC的首選化療藥物，近年來發展的緩釋給藥系統使化療藥物能夠持續穩定地釋放，且維持有效的藥物濃度，從而起到顯著的殺滅腫瘤細胞的效果。氟尿嘧啶緩釋劑較多用于外科手術中實體腫瘤切除后對腫瘤周邊組織的化療［5－7］，從而殺滅腫瘤的微轉移灶，對腫瘤的復發及預后有相當大的改善。

本研究的HE染色及抑瘤率結果表明氟尿嘧啶緩釋劑在對腫瘤的抑制方面比常規氟尿嘧啶制劑更有優勢，其對腫瘤的抑制殺滅效果更好，這可能歸功于緩釋給藥系統使藥物能夠達到較高的濃度，且作用持久［8］，將其用于結直腸癌術后的植入，對腫瘤微轉移的殺滅有相當大的作用。特別是對于晚期或者不適合做手術的患者，植入緩釋劑是個理想的選擇。

caspase－3在細胞凋亡caspase級聯反應中處于執行者的核心位置［9］，是細胞凋亡發生的關鍵步驟及一切凋亡信號傳導的共同通路。caspase－3的表達不僅反映細胞的凋亡水平，而且反映凋亡啟動因素的存在。本研究通過對荷瘤裸鼠采用不同的干預方式，發現用藥組caspase－3的表達都有不同程度增高，提示氟尿嘧啶制劑能啟動腫瘤細胞的凋亡程序，從而發揮抗瘤作用，這與張弦等［10］的研究一致。同時氟尿嘧啶緩釋劑組表現出更高的caspase－3表達，這跟其能夠達到更高的藥物濃度是分不開的，提示其促凋亡作用呈現劑量相關性，這與符立平等［11］研究的結果在一定程度是一致的。

綜上所述，氟尿嘧啶緩釋劑能夠更有效地誘導腫瘤細胞的凋亡而發揮抗腫瘤作用，進而抑制腫瘤的生長，且能減少腫瘤細胞異型性的發生，其在抗腫瘤方面呈現劑量相關性。氟尿嘧啶緩釋劑植入后能夠在局部達到較高的藥物濃度，所以其抗腫瘤效果明顯優于傳統方式，且其作用持久，值得在臨床作為結直腸癌的化療藥物推廣。

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