何首烏飲對(duì)Leydig細(xì)胞衰老模型β-半乳糖苷酶表達(dá)的影響*

宋慶亮，郭 銀，周 蕾，趙秀軍，牛嗣云△

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000;2.河北醫(yī)科大學(xué))

隨著人類預(yù)期壽命的延長(zhǎng)，遲發(fā)性性腺功能減退癥(late-onset hypogonadism,LOH)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。LOH也稱為中老年男性雄激素部分缺乏綜合征(partial androgen deficiency of the aging male,PADAM)，是一種隨老齡化血漿睪酮水平相對(duì)下降出現(xiàn)的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)是性功能障礙、情緒變化、睡眠欠佳、機(jī)體肌肉含量下降、疲乏、骨礦物質(zhì)減少等[1-2]。機(jī)體內(nèi)睪酮90%由睪丸Leydig細(xì)胞分泌。本研究采用H2O2和FeSO4損傷原代SD大鼠Leydig細(xì)胞建立Leydig細(xì)胞衰老模型，探討何首烏飲對(duì)大鼠Leydig細(xì)胞衰老模型β-半乳糖苷酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM/F12(GIBCO)、胎牛血清，北京四季青生物試劑公司;β-半乳糖苷酶試劑盒，北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心;膠原酶Ⅰ，美國(guó)Sigma公司。

1.2 何首烏飲含藥血清的制備 何首烏飲方劑由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓組成，各組分剪碎按質(zhì)量比3:2:3:2:5:3比例混合，加8倍量蒸餾水浸泡1h，文火水煎2次，每次30min，合并濾液濃縮至每ml含生藥4.8g。選用清潔級(jí)SD大鼠10只，雌雄不限(購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):1112043)，體重300±20g。按0.4ml/100g灌胃給予大鼠何首烏飲，1次/d，連續(xù)7d，末次給藥1h后，乙醚麻醉大鼠，頸動(dòng)脈插管放血，分離血清。

1.3 細(xì)胞分組處理 出生10-20d幼年雄性SD大鼠，無(wú)菌取雙側(cè)睪丸，用膠原酶Ⅰ消化至生精小管分散，1500r/min離心15min，加等量的PBS清洗3次，4℃離心(1100r/min，7min)，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1×106/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞采用3β-HSD特異性染色進(jìn)行鑒定[3]。正常組:Leydig細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)128h;Leydig細(xì)胞衰老損傷組:Leydig細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培養(yǎng)8h，移去H2O2和FeSO4后，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12中繼續(xù)培養(yǎng)72h;何首烏飲預(yù)防組:用10%含藥血清DMEM/F12培養(yǎng)基中原代培養(yǎng)Leydig細(xì)胞48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培養(yǎng)8h，移去H2O2和FeSO4后，繼續(xù)在10%含藥血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h;何首烏飲治療組:Leydig細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)48h后，加入50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4培養(yǎng)8h，移去H2O2和FeSO4后，在10%含藥血清DMEM/F12培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72h。

1.4 Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶表達(dá)的檢測(cè) 各實(shí)驗(yàn)組Leydig細(xì)胞原代培養(yǎng)并爬片，進(jìn)行相應(yīng)的處理后，用PBS漂洗兩次，再用含2%多聚甲醛和0.2 %戊二醛的固定液4℃固定15min，用含1mol/L MgCl2的PBS漂洗兩次，加入SA-β-gal染色液[1.2mM MgCl2,150mM NaCl,5mM K3Fe(CN)6,5mM K4Fe(CN)6,1mg/ml X-gal,100mM磷酸鈉緩沖液，pH6.0]，37℃孵育48h。PBS漂洗終止反應(yīng)，藍(lán)染細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。×200倍顯微鏡隨機(jī)選取視野，計(jì)數(shù)每10個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，每張切片觀察5個(gè)視野，每組觀察3張切片，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用S-N-K法。

2 結(jié)果

β-半乳糖苷酶定位在細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性產(chǎn)物呈藍(lán)色Leydig細(xì)胞衰老模型組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率明顯高于正常組(P＜0.05);何首烏飲預(yù)防組、治療組Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于模型組(P＜0.05);何首烏飲治療組、預(yù)防組Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見附表，附圖)。

附表 各組Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率(±s)

附表 各組Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率(±s)

與衰老組比較:*P＜0.05

組別 β-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞率(%)正常組 00.0±0.0*衰老模型組 98.3±2.8何首烏飲治療組 68.6±4.3*何首烏飲預(yù)防組 70.7±2.2*

附圖 各組Leydig細(xì)胞β-半乳糖苷酶的表達(dá)(×400)

3 討論

Dimiri等1995年首次提出一種鑒定細(xì)胞衰老的標(biāo)志酶—衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associate β-galactosidase,SA-β-Gal)，他們的研究發(fā)現(xiàn)，衰老成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞均表達(dá)此酶，而休眠細(xì)胞和終末分化細(xì)胞則缺乏。因此，目前將衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色作為細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志[4]。氧化損傷是目前建立細(xì)胞衰老模型常用的方法。H2O2屬于反應(yīng)性氧類，是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，可直接或間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;FeSO4參與機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)程，可增加反應(yīng)性氧的生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但同時(shí)加入H2O2與FeSO4后，細(xì)胞凋亡比例不但沒有增加，反而明顯降低，這是由于鐵劑抑制了H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，因此采用H2O2與FeSO4聯(lián)合處理細(xì)胞，可使細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，而減少凋亡的發(fā)生[5-6]。

補(bǔ)腎中藥何首烏飲由劉河間《宣明論方》何首烏丸加味而成，何首烏丸由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝組成，具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效，在此基礎(chǔ)上加淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)以強(qiáng)筋骨、丹參活血化淤以通心脈、茯苓健脾利濕以寧心神。前期研究發(fā)現(xiàn)，何首烏飲具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂和抑制卵巢、睪丸細(xì)胞凋亡的作用[7-10]。本研究進(jìn)一步觀察了何首烏飲對(duì)原代培養(yǎng)大鼠睪丸Leydig細(xì)胞衰老模型的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4聯(lián)合處理原代培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞，可使Leydig細(xì)胞衰老標(biāo)志性β-半乳糖苷酶的表達(dá)明顯升高;何約能源首烏飲用藥后可以明顯逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象，表明何首烏飲對(duì)H2O2和FeSO4引起的大鼠睪丸Leydig細(xì)胞衰老有一定的保護(hù)作用。

[1]郭凱華，高福祿，牛嗣云，等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠睪丸生殖功能的影響[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27(2):133-136.

[2]李維仁，韓勃萱，劉濤，等.老年人睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及StAR和P450scc蛋白表達(dá)的變化[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，43(4):505-508.

[3]應(yīng)峰，孫佳音，沈潔，等.大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定與功能監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)男科學(xué)雜志，2008，14(1):7-10.

[4]Dimiri GP, Lee X, Basile G, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo [J].Proc Natl Acad, 1995, 92(1): 93-106.

[5]顧曉蘇，顧永健，姜正林.刺五加皂甙對(duì)自由基作用和無(wú)血清培養(yǎng)條件下兩種神經(jīng)元衰老模型細(xì)胞的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(25):123-125.

[6]程志斌，王曉明，唐璐.過(guò)氧化氫及硫酸亞鐵誘導(dǎo)洋蔥表皮細(xì)胞凋亡[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(11):4898-4899.

[7]李亞麗,楚偉,郭文潮,等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠抗氧化能力及血脂的影響[J].中老年學(xué)雜志，2008，28(6):525-526.

[8]王小杰，牛嗣云，張艷青，等.何首烏飲對(duì)雄性衰老大鼠生殖功能的保護(hù)作用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(3):532-535.

[9]郭凱華，高福祿，牛嗣云，等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠睪丸組織細(xì)胞p53/Rb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].解剖學(xué)報(bào)，2010，41(3):435-439.

[10]李亞麗，郭文潮，余小平，等.何首烏飲對(duì)衰老大鼠卵巢增殖與凋亡的影響[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19(8):110-112.