東莨菪堿致學習記憶損傷大鼠不同腦區PREG含量的變化

李莎莎，侯艷寧

(1.承德醫學院生理學教研室，河北承德 067000;2.白求恩國際和平醫院藥劑科)

神經甾體指在中樞神經系統合成的或經血腦屏障進入神經系統發揮作用的甾體及其代謝衍生物。孕烯醇酮(PREG)是膽固醇合成神經甾體過程中最初的產物，具有神經調節和神經保護作用[1-2]。本研究通過制備東莨菪堿致學習記憶損傷大鼠模型，檢測模型動物相關腦區PREG的變化，初步探討學習記憶損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠16只，購自河北省實驗動物中心(合格證號909044)，體重200-220g。大鼠隨機分為模型組及生理鹽水對照組，每組8只。第1-5d定位航行實驗前30min，模型組大鼠腹腔注射東莨菪堿(2.0mg/kg)制作學習記憶損傷模型，對照組注射等量生理鹽水。

1.2 主要試劑及儀器 PREG，美國Sigma公司;氫溴酸東莨菪堿注射液，上海禾豐制藥有限公司。HP-1100高效液相色譜－質譜系統，美國安捷倫公司;高效液相色譜系統，日本島津公司;Oasis HLB 1cc固相萃取柱，美國Waters公司(30mg)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Morris水迷宮行為學測試:①第1-5d進行定位航行實驗:將大鼠從固定入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。②定位航行實驗結束后間隔1d撤去平臺，于第7d進行空間探索實驗:將大鼠從原固定入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠第一次到達原平臺所在位置的時間以及在180s內跨越原平臺所在位置的次數。

1.3.2 樣品采集、PREG提取及測定:空間探索實驗結束后大鼠斷頭處死，迅速剝開顱骨在4℃生理鹽水中分離額葉皮質及海馬，稱重后-70℃保存。參照文獻的方法[3]，經乙酸乙酯/正己烷液液萃取和固相小柱兩步法提取PREG并采用HPLC-MS法測定PREG含量。

1.4 統計分析 采用SPSS 11.5統計軟件行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮行為學測試結果 見表1-2。定位航行實驗結果顯示，第3d開始，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯長于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)?？臻g探索實驗結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠第一次到達原平臺位置的時間顯著延長(P＜0.05)，跨越原平臺所在區域的次數顯著減少(P＜0.05)。說明東莨菪堿致學習記憶損傷大鼠模型制備成功。

表1 大鼠定位航行實驗結果(±s，單位:s)

表1 大鼠定位航行實驗結果(±s，單位:s)

組別 n 第1d 第2d 第3d 第4d 第5d對照組 8 163.0±23.8 147.6±13.9 63.5±13.1 39.1±6.3 31.5±8.4模型組 8 172.8±15.9 143.9±21.5 149.1±24.1 96.0±39.9 53.9±24.0 P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 大鼠不同腦區PREG的含量 見表2。與對照組比較，東莨菪堿致記憶損傷大鼠額葉皮質PREG含量顯著下降(P＜0.05);海馬PREG含量無明顯變化。

表2 大鼠空間探索實驗成績和不同腦區PREG的含量(±s，n=8)

表2 大鼠空間探索實驗成績和不同腦區PREG的含量(±s，n=8)

組別 空間探索實驗成績 PREG含量(ng/g)時間(s) 次數 額葉皮質 海馬對照組 13.5±5.2 5.4±2.2 2.96±0.95 2.92±0.75模型組 41.0±17.9 2.6±1.9 2.02±0.56 2.89±0.93 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

3 討論

東莨菪堿致學習記憶損傷動物模型，是廣泛用于研究學習記憶損害相關機制以及篩選具有促進認知功能有效藥物的動物模型之一[4]。乙酰膽堿(ACh)是記憶形成的重要神經遞質，特別是皮質、海馬等腦區的ACh參與許多認知功能的調節，正常大鼠學習過程中不同腦區ACh的釋放量與大鼠的學習成績和記憶策略有關[5-6]。膽堿能神經元對空間記憶的調節主要通過M受體介導，并可引起突觸可塑性的改變。M受體拮抗劑東莨菪堿可通過阻斷ACh的受體結合位點，引起膽堿能系統功能障礙，影響信息處理的早期階段如信息的獲取及編碼，導致學習記憶受損。

記憶的獲取、再現及存儲鞏固需要海馬的參與，海馬在空間記憶中的作用依賴于海馬與不同皮質區域的相互聯系，這些皮質部位的損傷可導致實驗動物Morris水迷宮學習記憶能力下降。Morris水迷宮行為學實驗中，動物在多次訓練中學會通過視覺獲取空間參考信息并尋找到固定位置的隱蔽平臺，形成穩固記憶，這種記憶屬于空間參考記憶。參與空間參考記憶形成的神經通路主要有兩條，對視覺客體的記憶加工為枕葉-顳-前額葉皮質神經通路,對空間的記憶加工主要是枕葉-頂-前額葉皮質神經通路。研究發現，額葉皮質損傷的大鼠信息獲取功能受損，此類大鼠在尋找平臺的過程中顯示出隨機性和盲目性的特點[7-8]。

膽固醇在膽固醇側鏈裂解酶(P450SCC)的作用下生成PREG，它是神經甾體合成過程中最初的產物，通過作用于多種細胞膜受體快速調節神經細胞的興奮性和突觸可塑性。研究發現，PREG可提高大鼠在T迷宮等實驗中的學習能力[9]。PREG可通過拮抗GABAA受體、激動NMDA受體和sigma1受體導致動物腦組織ACh釋放增加，具有改善學習記憶的作用，但具體機制尚不明確[10]本實驗中M受體拮抗劑東莨菪堿致學習記憶損傷大鼠額葉皮質PREG含量顯著下降，提示東莨菪堿可能通過影響PREG的合成而損傷大鼠的學習記憶能力。

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