絲膠對2型糖尿病大鼠海馬nNOS表達的作用

李 強，顏 勇，蘇哲君，陳志宏

(1.承德醫學院，河北承德 067000;2.承德醫學院附屬醫院口腔科)

海馬與認知功能密切相關，可直接干預信息貯存和回憶，且是缺血損傷最敏感的腦區[1]。研究發現[2]，糖尿病時存在認知功能障礙，表現為學習、記憶和解決問題的能力下降。絲膠是蠶繭中的水溶性蛋白質，約占繭絲的30%左右，民間有蠶繭泡水降血糖的驗方。本課題組的前期研究發現，絲膠可明顯降低血糖和保護糖尿病時胰島細胞損傷[3-4]。本研究擬通過觀察2型糖尿病模型大鼠海馬神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表達的變化，探討絲膠保護糖尿病海馬損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 48只清潔級雄性SD大鼠，購自河北醫科大學實驗動物學部，合格證號:712024。48只SD大鼠隨機分組:正常對照組(n=12)，大鼠常規飼養，自由攝食、飲水;糖尿病模型組(n=12)，建立2型糖尿病動物模型后，不再做任何處理;絲膠治療組(n=12)，建立2型糖尿病動物模型后，給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃35d;二甲雙胍組(n=12)，建立2型糖尿病動物模型后，給予二甲雙胍(55.33mg/kg/d)灌胃35d。

1.2 糖尿病動物模型的建立 鏈脲佐菌素，臨用時用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液，按劑量25mg/kg連續腹腔注射(3d)，7d后以空腹血糖≥16.7mmol/L作為成模標準。

1.3 實驗藥物與試劑 鏈脲佐菌素，美國Sigma公司;絲膠，彩色蠶繭經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，蠶繭由承德醫學院蠶業研究所提供;鹽酸二甲雙胍，遼寧一成藥業有限公司;血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司;兔抗nNOS抗體，美國Santa Cruz公司。

1.4 指標檢測

1.4.1 血糖:各組大鼠禁食12h后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥于眶后靜脈叢采血，3000r/min離心20min，取血清采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4.2 海馬nNOS表達的檢測及定量分析:大鼠取血后4%多聚甲醛灌流固定，取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂的一段腦組織，4%多聚甲醛后固定過夜，常規石蠟包埋，連續冠狀切片，片厚6μm，自海馬水平部出現后取片。SP免疫組化染色觀察海馬水平部神經元nNOS的表達，一抗稀釋度為1:100，DAB顯色，蘇木素復染細胞核。以細胞漿出現棕黃色顆粒為nNOS陽性反應，以PBS代替一抗作為陰性對照。采用MiVnt圖像分析系統定量分析免疫組化陽性結果:10×20倍顯微鏡下于海馬水平部CA1區任意選取3個視野，以陽性產物面積與視野面積的比值作為nNOS的相對表達水平，每例標本選取5張切片，取平均值。

1.5 統計分析 采用SPSS 15.0統計軟件分析數據，行方差分析和兩兩比較的q檢驗。

2 結果

2.1 血糖 與正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01);絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠的血糖明顯低于糖尿病模型組(P＜0.01)，且絲膠治療組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見附表。

2.2 海馬神經元nNOS的表達 nNOS免疫陽性產物呈棕黃色細膩顆粒狀，位于海馬水平部各區神經元的胞漿。與正常對照組大鼠相比，糖尿病模型組大鼠海馬神經元nNOS的表達明顯升高(P＜0.01);絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠海馬神經元nNOS的表達明顯低于糖尿病模型組(P＜0.01，P＜0.05)，且絲膠治療組與二甲雙胍組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見附表。

附表 各組大鼠的血糖和海馬神經元nNOS的表達(±s)

附表 各組大鼠的血糖和海馬神經元nNOS的表達(±s)

與糖尿病模型組比較:*P＜0.01，**P＜0.05;與二甲雙胍組比較:#P＞0.05

組別 例數 血糖(mmol/L) nNOS正常對照組 12 10.83±2.03* 0.118±0.014*糖尿病模型組 12 29.45±4.82 0.155±0.019絲膠治療組 12 13.20±4.09*# 0.130±0.017*#二甲雙胍組 12 13.18±2.30* 0.137±0.018**

3 討論

NOS有三種同工酶，分別是內皮細胞中的內皮型NOS、神經元中的nNOS和血小板、巨噬細胞、膠質細胞中的誘導型NOS，它們均可催化L-精氨酸產生一氧化氮(NO)[5]。nNOS是鈣離子依賴性酶，主要存在于神經元內。生理情況下，nNOS的活性較低，通過合成NO發揮調節腦血流，介導神經元興奮性毒性及炎性損害等多種作用[6]。但nNOS與腦組織缺血缺氧密切相關，腦血氧供應減少可導致其表達上調[7]。本研究亦證實了這一點。糖尿病微血管病變可使毛細血管基底膜增厚、血管內皮細胞發生增生性改變，使毛細血管管腔變狹窄，再加上糖尿病患者脂代謝紊亂引起血流減慢，導致腦血流量減低，腦組織缺血缺氧，因此海馬nNOS的表達明顯升高。海馬缺血缺氧激活nNOS，導致NO過量生成[8]。NO是一種高度游離的氣體分子，在腫瘤殺傷、免疫防御、血管平衡及神經傳導等方面發揮重要作用[9]。神經系統內，一定量的NO可參與長時程增強(LTP)的產生與維持，但過量NO可產生神經毒性[10]。另外過量NO可與超氧陰離子結合介導多種細胞損傷。

我國糖尿病患者多以服用西藥控制血糖，在長期服用西藥的患者中，有很多人早期即可出現肝腎損害，因此西藥的毒副作用不容忽視。蠶繭由絲膠和絲素兩部分組成，我國應用蠶繭已有幾千年的歷史，但主要是將絲素用作衣料;絲膠是蠶絲中包被在絲素外面的高分子水溶性蛋白，具有多種生物學活性，但在繅絲時作為廢料丟棄本研究發現，絲膠可明顯降低2型糖尿病大鼠海馬nNOS的表達，推測絲膠可能通過下調海馬nNOS的表達減少海馬內過量的NO，減輕NO導致的神經元毒性和細胞損傷，具有保護糖尿病時海馬損傷的作用。

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