高糖高胰島素對MCF-7細胞FASN蛋白表達的影響*

賀曉磊，王麗紅，高 宇△，劉曉燕，李桂芳

(1.承德醫學院，河北承德 067000;2.承德醫學院附屬醫院)

脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FASN)是人體內脂肪酸從頭合成途徑的關鍵酶，在人體的能量代謝中具有重要作用。研究發現，在惡性腫瘤中FASN的表達升高，活性增強，并且FASN表達升高嚴重影響腫瘤患者的預后。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，國內外學者均發現，伴有2型糖尿病的乳腺癌患者預后不良。2型糖尿病發病機制之一是由于胰島素抵抗產生的高胰島素血癥，引起體內血糖升高。乳腺癌合并2型糖尿病是乳腺癌復發和轉移的獨立預后危險因素，但發病機制不明[1-2]。本研究擬觀察高糖、高胰島素環境對乳腺癌細胞MCF-7 FASN表達的影響，探討FASN在乳腺癌合并糖尿病發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM低糖培養基，美國Hyclone公司;小鼠抗人FASN單克隆抗體，美國BD公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG二抗，美國KPL公司;胎牛血清、D-glucose，上海生工;BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光液，北京普利萊公司;生物合成人胰島素，諾和諾德公司;MCF-7細胞，由承德醫學院附屬醫院中心實驗室提供。

1.2 細胞培養與分組 低糖DMEM培養基培養MCF-7細胞，含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素，D-glucose濃度5mmol/L，37℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞長滿至80%時，用0.25% Trypsin-EDTA消化傳代。實驗分為對照組、高胰島素組、高糖組和高糖高胰島素組。對照組D-glucose濃度5mmol/L;高糖組D-glucose濃度20mmol/L;高胰島素組D-glucose濃度5mmol/L，胰島素濃度125mU/L;高糖高胰島素組D-glucose濃度20mmol/L,胰島素濃度125mU/L。每組細胞培養12h，提取總蛋白。

1.3 Western印跡分析 采用Western Blot法檢測MCF-7細胞FASN蛋白的表達。細胞用預冷的PBS沖洗3遍，加入200μl含有1% PMSF的RIPA細胞裂解液(150mmol/L sodium chloride,1% NP-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1%SDS,50mmol/L Tris,pH 8.0)，收集細胞至離心管中，4℃、12000r/min離心20min，取上清用BCA法定量蛋白濃度。每孔蛋白樣品上樣量30μg，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜上，5%牛奶(TBST配置)封閉2h，一抗(FASN 1:600，β-actin 1:1000)4℃孵育過夜，二抗(1:5000)孵育1h，ECL超敏發光液顯影。膠片掃描后采用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，計算目的條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統計分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據行One-Way ANOVA分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Western Blot結果顯示，與對照組比較，高糖組、高胰島素組、高糖高胰島素組MCF-7細胞FASN蛋白的表達明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.05);高糖組、高胰島素組、高糖高胰島素組MCF-7細胞FASN蛋白表達比較差異無統計學意義(P＞0.05)。(見附圖、附表)。

附表 各組MCF-7細胞FASN蛋白的表達(±s，n=3)

附表 各組MCF-7細胞FASN蛋白的表達(±s，n=3)

與對照組比較:*P＜0.05

組別 FASN蛋白的表達對照組 0.162±0.014高胰島素組 0.219±0.004*高糖組 0.300±0.006*高糖高胰島素組 0.317±0.006*

附圖 各組細胞FASN蛋白的表達

3 討論

研究表明，2型糖尿病增加患乳腺癌的風險，并增加乳腺癌患者的死亡率。癌細胞普遍的行為表現為無節制的生長并侵襲周圍的正常組織，脂肪酸的內源性合成為腫瘤生長提供能量。脂肪酸合成酶(FASN)是內源性脂肪酸合成的關鍵酶，本研究采用Western蛋白印記法觀察發現，與對照組相比，高糖組、高胰島素組和高糖高胰島素組乳腺癌MCF-7細胞FASN蛋白的表達均明顯升高。葡萄糖不僅是機體重要的能量來源，還參與能量的儲存和轉運，動物實驗發現糖尿病誘導的葡萄糖和游離脂肪酸含量升高在體內和體外都與腫瘤生長有關[3]。胰島素抵抗是2型糖尿病患者的發病機制之一，并由此產生高胰島素血癥。高胰島素血癥在絕經前和絕經后的女性中都是乳腺癌發生的危險因素。通過對乳腺癌術后患者的隨訪發現，高胰島素水平的患者病死率明顯升高[4]。本研究發現高胰島素可使MCF-7細胞FASN的表達增加，因此使腫瘤細胞脂肪酸合成增加，導致腫瘤細胞生長旺盛。

腫瘤組織FASN表達升高影響腫瘤治療的預后。Walter等[5]通過對前列腺癌患者的隨訪發現，患者術后體內FASN表達水平較術前明顯下將，生存率提高，而FASN表達升高則與前列腺癌的復發相關。本研究顯示，盡管高糖合并高胰島素組與單獨高糖、高胰島素組FASN蛋白表達差異無統計學意義，但高胰島素組、高糖組、高糖高胰島素組FASN的表達有逐漸升高的趨勢，而2型糖尿病患者多數伴有高血糖和高胰島素血癥。本研究結果表明，高胰島素和高糖促進FASN高表達可能是乳腺癌合并2型糖尿病人群病情不易控制、預后不良的原因之一。

除乳腺癌外，前列腺癌、肺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織均發現FASN的高表達。目前，越來越多的研究把FASN作為抗腫瘤治療的靶點。FASN活性增加與胰島素相關的代謝紊亂，如肥胖等以及多種癌癥有因果關系[6]。本研究結果對于揭示乳腺癌合并糖尿病患者生存預后，尋求治療乳腺癌患者的藥物作用靶點，具有一定的參考價值。

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