丙戊酸鈉對K562細胞的增殖抑制作用

薛 倩，張志華，趙 蕾，郝長來△

(1.承德醫學院，河北承德 067000;2.承德醫學院附屬醫院)

近年來，國內外大量文獻證明丙戊酸鈉(VPA)具有抑制組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的作用，能調節細胞周期，誘導多種實體瘤和急性白血病細胞分化和凋亡[1-3]。腫瘤的發生被認為是細胞凋亡與細胞增殖平衡失調的結果，目前發現多種腫瘤與細胞凋亡規律異常有關，癌基因和抑癌基因的突變、失活、失調包含于發病機制之中。本研究以t(9;22)攜帶有特征性融合基因BCR/ABL慢性髓系白血病(CML)細胞株K562細胞為靶細胞，探討VPA對慢性髓系白血病細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 K562細胞株，中國醫學科學院血液學研究所王建祥教授惠贈。VPA、RPMI 1640、噻唑藍(MTT)，美國Sigma公司;胎牛血清，上海生工公司;Bcl-2、Bax、β-actin一抗和二抗，美國Santa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:K562細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，加入青霉素(100U/m1)和鏈霉素(100U/ml)，在37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2 細胞增殖的MTT法檢測:取對數生長期K562細胞，接種于96孔板內，調整密度為2×105/ml，每孔90μl，實驗組細胞分別加入不同濃度的VPA(0.5、1、2、3、4mmol/L)，10μl/孔，對照組細胞不加藥物，另設空白組(只加培養基，不加細胞和藥物)，每組均設3個復孔。96孔板置于37℃、5% CO2培養箱培養72h后，加入5mg/ml的MTT溶液20μl/孔，繼續培養4h，然后加入三聯裂解液[10% SDS+5% 異丁醇+1% HCL(10mol/L)，100μl/ 孔]，37℃放置過夜后，用酶標儀于波長570nm處讀取吸光度(OD)值，根據OD值計算細胞增殖抑制率:細胞增殖抑制率(%)=[對照孔OD值-實驗孔OD值]/[對照孔OD值-空白孔OD值]×100%。并計算細胞增殖抑制率為50%時的藥物濃度(IC50)。

1.2.3 Western Blot法檢測K562細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達:取對數生長期的K562細胞，調整細胞密度為5×105/ml,分為對照組和VPA 3mmol/L處理組。培養72h后收集細胞，RIRA裂解液(50mmol/L Tris-Cl pH8.0，1% NP-40，150mmol/L NaCl，0.5% 去 氧 膽 酸鈉，0.1% SDS,100mmol/L PMSF)裂解細胞，提取總蛋白質，BCA法定量蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離，蛋白樣品上樣量每孔50μg，然后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，鼠抗人Bax、鼠抗人Bcl-2抗體(1:200稀釋)4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯兔抗鼠二抗，ECL顯影，曝光。采用Quantity Qne-v 4.6.2軟件對顯影條帶進行分析，以目的條帶的灰度值與β-actin(1:1000)條帶的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.3 統計分析 采用SPSS 17.0統計軟件行方差分析和兩樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VPA對K562細胞增殖的抑制作用 不同濃度VPA處理K562 細胞后，細胞增殖明顯受抑，VPA 0.5、l、2、3、4mmol/L處理組的細胞增殖抑制率明顯高于對照組(P＜0.01);并且，VPA對K562細胞的增殖抑制作用具有濃度依賴性，VPA各濃度K562細胞增殖抑制率比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表1。VPA處理K562細胞72h的IC50=(2.34±0.14)mmol/L。

表1 MTT法檢測K562細胞的增殖抑制率(±s)

表1 MTT法檢測K562細胞的增殖抑制率(±s)

與對照組比較:*P＜0.01;VPA不同濃度間比較:P＜0.01

組別 OD570 抑制率(%)空白組 0.314±0.012 ---對照組 1.112±0.027 0 VPA 0.5mmol/L 0.959±0.013 19.19±3.39*VPA 1.0mmol/L 0.873±0.010 29.98±2.44*VPA 2.0mmol/L 0.765±0.008 44.78±2.75*VPA 3.0mmol/L 0.614±0.008 62.35±1.77*VPA 4.0mmol/L 0.565±0.012 68.63±2.26*

2.2 VPA處理K562細胞后Bax和Bcl-2蛋白表達的變化 與對照組比較，3mmol/L VPA處理K562細胞后，Bax蛋白的表達明顯升高，Bcl-2蛋白的表達明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表2 K562細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達(±s)

表2 K562細胞Bax和Bcl-2蛋白的表達(±s)

組別 實驗重復次數 Bax Bcl-2對照組 3 0.207±0.015 0.412±0.033 VPA 3mmol/L組 3 0.621±0.009 0.104±0.011 P ＜0.01 ＜0.01

3 討論

研究證實，保守位點的乙酰化修飾可以影響DNA與轉錄調節復合物的結合，調控DNA的復制和修復、基因表達、染色質組裝和細胞有絲分裂[4]。組蛋白乙酰化酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)可調控這種修飾作用，因此HATs/HDACs的失衡可使基因表達紊亂，從而導致腫瘤的發生。HDAC抑制劑VPA及類似物可以抑制Ⅰ類和Ⅱ類HDAC(不包括HDAC6和HDAC10)中多種HDAC的活性，使組蛋白H3和H4氨基末端超乙酰化，明顯調節細胞增殖和凋亡相關基因的表達，從而起到抗白血病的作用[5-6]。

K562細胞株是研究慢性髓系白血病的理想細胞株，來自慢粒急變患者，攜帶有t(9;22)易位產生的特征性融合基因BCR/ABL，編碼的P210融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，可影響細胞內的信號傳導和黏附分子的功能，干擾細胞凋亡，在慢性髓系白血病的發病機制中發揮關鍵性的作用。雖然臨床新藥伊馬替尼針對BCR/ABL基因產物P210蛋白取得了很好的藥效，但在加速期和急變期患者仍然觀察到了原發性和繼發性耐藥現象，因此臨床上需要開發新一代作用于P210融合蛋白的靶向藥物或其它不同機制的抗腫瘤藥物[7]。細胞凋亡的信號通路包括線粒體參與的內源性路徑、死亡受體介導的外源性路徑或內質網信號路徑，最終匯集到caspase激活的路徑。細胞凋亡的調控涉及許多基因，包括一些與細胞增殖有關的原癌基因和抑癌基因，其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM 等。Bcl-2蛋白家族是凋亡的主要調節者，可分為兩類，一類是抗凋亡基因，如:Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1，另一類是促凋亡基因，如:Bax、Bak、Bad、Bid、Bim 等。Perkins等的實驗研究證實，半胱氨酸蛋白酶(caspases)原通過與凋亡誘導蛋白Apaf-1的NH2-末端區域結合而激活，抗凋亡蛋白可直接與Apaf-1結合，抑制它同caspases原的交聯，從而抑制caspases-9的激活[8]。Bax可把Apaf-1從抗凋亡的結合中釋放出來，引起線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C，激活caspases發生自身催化的化學反應，從而導致細胞凋亡。本研究應用VPA作用于慢性髓系白血病細胞株K562細胞，MTT法檢測發現K562細胞的增殖明顯受到抑制，同時發現促凋亡蛋白Bax的表達升高、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低。表明VPA可通過上調Bax的表達、下調Bcl-2的表達，誘導K562細胞凋亡，關于VPA誘導K562細胞凋亡是否通過caspase非依賴的其它凋亡信號途徑，尚待進一步的研究。

[1]Gotflicher M, Minucci S, Zhu P, et a1. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells[J]. EMBO J, 2001, 20(24): 6969-6978.

[2]Takai N, Desmond JC, Kumagai T, et a1. Histone deacetylase inhibitors have a profound antigrowth activity in endometrial cancer cells[J].Clin Cancer Res,2004,10(3):1141-1149.

[3]Deubzer H, Busche B, Ronndahl G, et a1. Novel valproic acid derivatives with potent differentiation-inducing activity in myeloid leukemia cells[J].Leuk Res,2006,30(9):1167- 1175.

[4]Huang C, Sloan EA, Boerkoel CF. Chromatin remodeling and human disease[J].Curr Opin Genet Dev, 2003, 13(3): 246-252.

[5]Gurvich N,Tsygankova OM,Meinkoth JI,et al.Histone deacetylase is a target of valproic acid-mediated cellular differentiation[J].Cancer Res,2004, 64(3):1079-1086.

[6]Thelen P, Schweyr S, Hemmerlein B, et al. Expressional changes after histone deacetylase inhibition by valproic acid in LNCaP human prostate cancer cells[J].Int J Oncol,2004, 24(1):25-31.

[7]Hunter T. Treatment for chronic myelogenous leukemia:the long road to imatinib[J].J Clin Invest, 2007,117(8):2036-2043.

[8]Perkins C,Kim CN,Fang G, et al.Arsenic induces apoptosis of multidrug-resistant human myeloid leukemia cells that express Bcr-Abl or over express MDR,MRP,Bcl-2,or Bcl-xL[J].Blood,2000,95(3):1014-1022.

[9]Adams JM,Cory S.The Bcl-2 protein family:arbiters of cell survival[J].Science,1998,281 (5381):1322-1326

[10]Joensuu H, Pylkkanen L, Toikkanen S. Bcl-2 protein expression and long-term survival in breast cancer[J]. Am J Pathol, 1994,145(5): 1191-1198.